莫曉山，馮旭，楊樂

［1.湖南省計量檢測研究院，長沙 410004；2.島津企業(yè)管理(中國)有限公司北京分公司，北京 100020］

近年來生物制藥市場發(fā)展迅速，2015年全世界生物藥品銷售預計將達到2 100億美元，生物制藥已經(jīng)成為很多制藥企業(yè)的發(fā)展戰(zhàn)略方向。目前世界5個頂尖制藥企業(yè)中4個是生物制藥企業(yè)。除了新藥研發(fā)公司外，生物仿制藥行業(yè)發(fā)展也非常迅速。隨著生物制藥的迅速發(fā)展，各種生物藥品團聚顆粒濃度測試方法不斷涌現(xiàn)。北京化工大學的李甜等［1］研究了利用暗場散射探針法測試金納米顆粒濃度的方法；陸曉蘭等［2］用圖像分析儀測定癌癥組織中核仁組成區(qū)嗜銀蛋白顆粒計數(shù)，并研究了其對癌癥患者預后的意義；Kouri等［3］介紹了ISLH推薦的相差顯微鏡法對尿液中細胞的計數(shù)方法；謝敏等［4］研究了用透光率脈動檢測儀(PDA)測量水中微米級別微生物等懸浮顆粒濃度的方法；張軍霞等［5］采用分子排阻色譜法考察了雙黃連注射液中高分子聚合雜質(zhì)；顧立素等［6］采用凝膠色譜法研究了利用凝膠色譜法測定安美汀藥物中高分子聚雜質(zhì)。

根據(jù)粒徑大小，生物藥品團聚物可大致分為3類：小于100 nm，100 nm～10 μm，大于10 μm。生物制藥行業(yè)最關心的是100 nm～10 μm范圍粒子濃度的測試。在生物制藥生產(chǎn)研發(fā)的每個階段，都需要對此范圍內(nèi)的團聚物進行評估，這3類團聚物濃度常用測試方法：小于100 nm的樣品采用體積排阻色譜法(SEC)；大于10 μm的樣品采用液體顆粒計數(shù)儀；100 nm～10 μm范圍內(nèi)的粒子被稱為亞可見粒子(SVP)。目前市場上能有效進行測量SVP團聚物濃度的方法較少。筆者以下介紹納米激光粒度法在測定生物藥品團聚物濃度方面的應用。

1 生物藥品團聚過程

將西藥以藥物分子大小細分，大體可以分為化學藥物和生物藥物兩類，二者在生產(chǎn)方法、使用方式及功效等方面有所不同?；瘜W藥物的相對分子質(zhì)量較低，多采用化學合成方式生產(chǎn)，產(chǎn)品以口服藥、注射藥等為主；生物藥品的相對分子質(zhì)量較大，采用基于基因科技的生物細胞法生產(chǎn)。

生物藥品又分為有抗體、蛋白質(zhì)和核酸藥物，主要類型是抗體藥物?？贵w藥物直接消滅細胞、病毒及其它致病的抗原載體或抵消其毒性。

生物制藥行業(yè)的基本任務是為患者制造和儲存藥物單體形式的生物藥品，而團聚物是藥物單體的團聚體，如圖1所示。

圖1 生物藥品單體的團聚過程

生物藥品單體的團聚現(xiàn)象比較普遍，如個別蛋白質(zhì)特殊物理特性可能導致生物藥品團聚，運輸或儲存過程中的振蕩、外界污染，甚至用藥過程中的一些因素等也會造成藥品單體的團聚［7］。隨著藥物團聚物越來越大，其藥效會隨之減小，而且可能會產(chǎn)生危險的副作用，比如人體免疫反應導致的休克，甚至死亡［8］。所以對于生物制藥生產(chǎn)商而言，抑制有害的團聚物形成，及時檢測團聚物粒徑范圍及濃度變得異常重要。生物制藥生產(chǎn)過程中藥物團聚抑制研究、藥物儲存方法開發(fā)和質(zhì)量控制都需要對藥品的團聚物進行檢測。

2 團聚物濃度測試原理

目前有些粒子測定儀，如島津推出的SALD-7500 nano型粒子測定儀可以檢測7 nm～800 μm范圍粒子的粒徑，并且可定量檢測100 nm～10 μm范圍內(nèi)生物制藥團聚物的濃度，團聚物形成過程及濃度變化［9］。例如樣品A和B為不同濃度的同種顆粒樣品，用傳統(tǒng)的激光粒度測定時，可以得到散射光強度分布（如圖2所示）。

圖2 樣品A和樣品B的光強度分布圖

雖然各檢測器元件之間的相對強度關系是相同的，單一元件所測的光強度與顆粒的濃度成正比，但傳統(tǒng)激光粒度儀只能得到相同的粒度分布數(shù)據(jù)，而不能發(fā)現(xiàn)濃度的不同（如圖3所示）。SALD-7500nano系統(tǒng)能夠進一步分析與顆粒濃度成正比的光強度數(shù)據(jù)，并通過聚苯乙烯標準顆粒溶液進行校準，獲得以質(zhì)量濃度(μg／mL)形式給出的粒度分布數(shù)據(jù)，即濃度分布（如圖4所示）。

圖3 相對粒度分布圖

圖4 顆粒的濃度分布圖

3 生物藥品團聚物濃度測量應用實例

在監(jiān)控生物藥品團聚物的實驗結果中，若峰高增大，表示團聚物數(shù)量增加；若峰向大粒子方向移動，則表示團聚物粒徑增大（如圖5所示）。

在生物醫(yī)藥中，為防止藥品發(fā)生團聚，通常加入藥物穩(wěn)定劑來阻止藥物團聚的形成，而藥物穩(wěn)定劑的效果評估則需要監(jiān)測團聚物濃度。在圖6、圖7所示的例子中，L-精氨酸被當作穩(wěn)定劑添加到牛血清蛋白（BSA）分散液（pH5的三羥甲基氨基甲烷緩沖液）中。在人為機械攪拌刺激下，團聚物很快形成，而穩(wěn)定劑抑制團聚的效果可以定量評估。從圖6結果顯示，加入L-精氨酸的牛血清蛋白分散液中，團聚物顆粒數(shù)量明顯減少，實驗數(shù)據(jù)見表1。圖7為加入L-精氨酸與不加L-精氨酸攪拌處理后牛血清蛋白團聚物濃度的測量結果。

圖5 SALD-7500nano 測定聚合物濃度結果圖

圖6 不同攪拌時間下加入L-精氨酸前后團聚物濃度

圖7 BSA團聚測定結果

表1 牛血清蛋白加入L-精氨酸前后團聚物濃度 μg/mL

4 結語

探討了生物制藥蛋白質(zhì)團聚物濃度測量的重要性，并通過測定實例，介紹了一種采用納米激光粒度法測定生物藥品團聚物濃度的方法。此方法既可以測量納米級顆粒樣品的粒度范圍，又可以對生物藥品中藥物單體團聚物濃度進行測試監(jiān)控，以對藥品藥效、安全性能等方面進行評價。

［1］李甜，許瀟，徐重行，等.金納米顆粒暗場散射成像計數(shù)檢測凝血酶［C］//中國化學會第29屆學術年會.北京，2014.

［2］陸曉蘭，易為民，王蘭芬.細胞核DNA含量測定和AgNOR顆粒計數(shù)對預測卵巢囊腺癌患者預后的意義［J］.癌癥，2003，22(1): 62–65.

［3］Kouri T，Gyory A，Rowan R M. ISLH recommended reference procedure for the enumeration of particles in urine ［J］. Lab Hematol，2003(9): 58-63.

［4］謝敏，劉小波.透光率脈動檢測儀PDA在水中顆粒計數(shù)中的應用［J］.凈水技術，2009，28(4): 71-73.

［5］張軍霞，仲平.分子排阻色譜法檢測雙黃連注射液中的高分子雜質(zhì)［J］.沈陽藥科大學學報，2014，31(6): 468-471.

［6］顧立素，胡昌勤，金少鴻.安美汀中高分子雜質(zhì)的分離分析與質(zhì)量控制［J］.藥物分析雜志，2001，21(1): 13-15.

［7］袁雯瑋.高分子聚合物研究與中國藥典2005年版β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物修訂情況及操作要點［J］.中國抗生素雜質(zhì)，2005，30(12): 727-730.

［8］王秀玲，張岳光，張靜. IgA-纖維連接蛋白聚合物的影響［J］.醫(yī)藥與保健，2014，22(1): 2-4.

［9］日本島津公司. SALD–7500nano納米激光粒度儀［J］.傳感器世界，2013(10): 52-52.