劉家儀 ，楊麗濤 1，，李楊瑞 1，

（1.亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室/廣西大學農(nóng)學院，南寧 530005；2.中國農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究中心/廣西農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所，農(nóng)業(yè)部廣西甘蔗生物技術與遺傳改良重點實驗室/廣西甘蔗遺傳改良重點實驗室，南寧 530007）

我國甘蔗80%以上種植在旱坡地上，大部分沒有灌溉條件，適應旱坡地的高產(chǎn)高糖甘蔗良種及先進適用的旱地甘蔗栽培技術顯得日益重要[1]。融合了分子標記、雜交選育等常規(guī)手段的農(nóng)作物生物育種技術，是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與產(chǎn)業(yè)化的重要領域，帶來了巨大的經(jīng)濟、社會和生態(tài)效益[2]?？梢?，利用農(nóng)作物生物育種技術培育適應旱坡地的高產(chǎn)高糖甘蔗品種是可行高效的方法。G418（geneticin）在水稻、小麥、甘蔗的抗性篩選利用上已有一些報道[3-5]，但不同作物或同一作物不同品種的適宜濃度差異較大[6]。甘蔗基因工程研究最初以抗除草劑和抗蟲轉(zhuǎn)基因研究為主，隨后抗病、非生物脅迫轉(zhuǎn)基因、轉(zhuǎn)基因甘蔗作為生物反應器生產(chǎn)重組蛋白（GM-CSF等）和生物塑料聚羥基丁酸酯（PHB）也取得了很好的成果[7]。目前澳大利亞、巴西、哥倫比亞、美國、中國、毛里求斯以及南非等國的甘蔗轉(zhuǎn)基因研究都取得了顯著進展[8]。但是，甘蔗生物育種技術還存在轉(zhuǎn)化效率低、轉(zhuǎn)基因甘蔗安全性問題研究比較少、多基因?qū)Ω收徇M行轉(zhuǎn)化比較少等一些問題[9]。甘蔗愈傷組織的獲得主要有兩種方法，一是誘導嫩葉外植體產(chǎn)生愈傷組織，二是誘導莖頂端生長點產(chǎn)生愈傷組織。研究發(fā)現(xiàn)莖尖定芽的組織培養(yǎng)變異性小且繁殖速度快[10-12]。NTPⅡ篩選標記基因使植物細胞產(chǎn)生對氨基糖苷類抗生素如G418、卡那霉素（kanamycin）等的抗性[6]。單子葉植物對卡那霉素表現(xiàn)出很高的天然抗性，特別是甘蔗經(jīng)卡那霉素處理后，出現(xiàn)非常嚴重的白化苗現(xiàn)象[13]。通過基因槍或農(nóng)桿菌進行植物基因工程育種的關鍵環(huán)節(jié)之一是建立一個高效的組織培養(yǎng)再生體系[14]。ROC22是廣西的主栽品種，通過和其它品種的比較發(fā)現(xiàn)其整體性狀相對比較好[15]，但是這個品種的篩選濃度目前還未見報道。篩選甘蔗品種ROC22莖尖組織培養(yǎng)每個階段的最佳G418濃度，為通過遺傳轉(zhuǎn)化改良甘蔗品種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 甘蔗品種ROC22，由廣西大學甘蔗研究所提供。

1.1.2 試劑和藥品 G418購自生工生物工程（上海）有限公司、其他常規(guī)藥均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 甘蔗愈傷組織培養(yǎng) 選取生長旺盛、大小基本一致的愈傷組織（直徑約為3 mm），每個培養(yǎng)皿接種4個甘蔗愈傷，設3個G418濃度梯度：0（CK）、10、20 mg/L，每個濃度設3個重復。用繼代培養(yǎng)基（CM2）：MS+2 mg/L 2,4-D+30 g/L蔗糖+6.5 mg/L瓊脂粉，pH=5.8培養(yǎng)，在25～27℃黑暗條件下培養(yǎng)，誘導再生愈傷組織，每兩個星期換一次培養(yǎng)基。

1.2.2 甘蔗分化培養(yǎng) 選取生長旺盛的大小基本上一致的愈傷組織（直徑約為3 mm），每個組培瓶接種3個甘蔗愈傷，設 5 個 G418 濃度梯度：0（CK）、10、20、30、40 mg/L，每個濃度設 3 個重復。 在分化培養(yǎng)基（CM3）：MS+2 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.5 mg/L瓊脂粉，pH=5.8上培養(yǎng)，25～27℃， 每天 12～14h 2000 lx的光照條件下培養(yǎng)，每兩個星期換一次培養(yǎng)基分化幼苗。

1.2.3 甘蔗生根培養(yǎng) 選取生長旺盛大小基本一致的幼苗（高約為4～5 cm），每個組培瓶接種1～2株，設5個 G418 濃度梯度：0（CK）、10、20、30、40mg/L，每個濃度設 3 個重復。在生根培養(yǎng)基（CM4）：1/2 MS+4 mg/L NAA+40 g/L蔗糖+6.5 mg/L瓊脂粉，pH=5.8上培養(yǎng)，25～27℃，每天12～14h 2000 lx的光照條件下培養(yǎng)，每兩個星期換一次培養(yǎng)基生根。

2 結(jié)果與分析

2.1 G418對甘蔗愈傷組織生長的抑制作用

在CM2培養(yǎng)基中進行甘蔗愈傷組織培養(yǎng)，結(jié)果（圖 1、圖 2A）顯示，G418濃度為 0 mg/L（CK）的愈傷組織能正常生長，愈傷活力強，基本上無褐化。當G418濃度為10 mg/L時，愈傷生長受到了抑制，部分愈傷褐化，但依然有部分材料可以成活。當G418濃度為20 mg/L時，愈傷嚴重褐化，無一愈傷可以成活。由此可見，甘蔗愈傷組織生長最佳的篩選濃度為20 mg/L。

圖1 不同G418濃度對甘蔗愈傷生長成活率的影響

圖2 不同G418濃度對甘蔗愈傷生長（A）、分化（B）及生根（C）成活率的影響

圖3 不同G418濃度對甘蔗愈傷分化成活率的影響

2.2 G418對甘蔗愈傷分化的影響

在CM3培養(yǎng)基中進行甘蔗愈傷誘導成苗的試驗，G418濃度為0 mg/L（CK）、10 mg/L、20 mg/L時，甘蔗愈傷組織均能長出苗（圖2B、圖3），而且試驗發(fā)現(xiàn)G418濃度為10 mg/L、20 mg/L比0 mg/L苗生長的數(shù)量要多，速度要快，特別是G418濃度為10 mg/L。當G418濃度為30 mg/L時，在誘導成苗的初期，會看到有小苗長出來，但是在生長的后期可以發(fā)現(xiàn)，這些小苗最終都會死掉。在G418濃度為40 mg/L時，甘蔗愈傷均不能誘導成苗。如果篩選濃度為30 mg/L，甘蔗愈傷分化的初期，還是會有苗長出來，為了避免干擾，我們認為甘蔗愈傷分化的最佳篩選濃度40 mg/L為宜。

2.3 G418對甘蔗小苗生根的影響

圖4 不同G418濃度對甘蔗生根成活率的影響

在CM4培養(yǎng)基中進行甘蔗生根試驗，G418 濃度為 0 mg/L（CK）時，甘蔗能正常生根（圖2 C、圖4），根長出來的數(shù)量多，有根長出的時間明顯比其他幾個濃度的短，當G418濃度為10 mg/L、20 mg/L時，甘蔗可以長出根，但是需要的時間明顯比CK的要長，而且長出根的數(shù)量少，根相對CK要短。在G418濃度為30 mg/L時，在初期甘蔗還有一兩株綠色的小苗長出來，但是隨著時間的推移，這些甘蔗苗會全部死掉。當G418濃度為40 mg/L時，甘蔗不能長綠色的小苗，也不能長出根。由此可見，甘蔗生根的最佳篩選濃度為30 mg/L。

3 結(jié)論與討論

本研究甘蔗品種ROC22莖尖愈傷組織生長、分化、小苗生根階段的最佳G418濃度分別為20 mg/L、40 mg/L、30 mg/L?！?0mg/L濃度的G418能促進甘蔗分化，當G418達到一定濃度甘蔗組織不能正常生長，甚至導致其死亡。因此G418可用于篩選帶有其抗性的植株。

本研究結(jié)果和陳華平[5]（2005）、林美娟[6]（2006）的研究結(jié)果較接近，但是由于所用材料甘蔗品種不一樣，所以也存在一定的差距。甘蔗是高度雜合的異源多倍體和多倍的非整倍體單子葉植物，遺傳背景復雜，致使利用傳統(tǒng)育種方法從有性雜交到良種育成要10～13年，周期長，成效低[16-17]。而且甘蔗轉(zhuǎn)基因技術還存在轉(zhuǎn)化效率低等問題。因此找到適合甘蔗高效的啟動子和建立一個高效的用于遺傳轉(zhuǎn)化的組織培養(yǎng)再生體系就顯得尤為重要。多倍體植物基因通常含有8～10個等位基因，給甘蔗啟動子的分離造成較大的困難[7]。試驗過程中發(fā)現(xiàn)，組培材料的大小會導致其對G418的抗性不一致，組培材料越大其對G418抗性越強。所以在試驗時一定要嚴格控制組培材料的大小，使其大小盡量保持一致。NPTⅡ是植物遺傳轉(zhuǎn)化應用最廣泛的選擇標記基因之一，其可使植物細胞產(chǎn)生G418抗體。一定濃度的G418可以很好地抑制甘蔗組織生長，導致其最終死亡。所以用G418建立最優(yōu)的篩選體系，為后續(xù)的甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化做好準備。NPTⅡ也可產(chǎn)生卡那霉素的抗性，在許多雙子葉植物，例如煙草上得到廣泛的使用。但是單子葉植物對卡那霉素有天然的抗性，使用很高的濃度也一樣會有植物體成活，還會產(chǎn)生白化苗。

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