王安平， 朱善元， 吳 雙， 王永娟， 左偉勇， 洪偉鳴

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院/江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 泰州225300)

禽腺聯(lián)病毒(Avian adeno-associated virus，AAAV)于1973 年由Yates 等［1］首次報(bào)道，AAAV 病毒粒子直徑為20 ～25 nm，呈正二十面體對(duì)稱，由3 個(gè)衣殼蛋白質(zhì)構(gòu)成，無(wú)包膜，基因組大小為4 700 bp，兩端是末端反向重復(fù)序列(Inverted terminal repeat，ITR)，中間部分含有2 個(gè)大的開(kāi)放閱讀框架及3 個(gè)啟動(dòng)子，分別編碼結(jié)構(gòu)基因Cap和非結(jié)構(gòu)基因Rep。Cap基因的轉(zhuǎn)錄從p40 啟動(dòng)子開(kāi)始，分別從主要的起始密碼子AUG 和次要的起始密碼子ACG 形成mRNA，然后再經(jīng)過(guò)剪接形成3 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)VP1、VP2和VP3，在成熟毒粒中的比例大約為1 ∶1 ∶10。VP1在病毒顆粒的穩(wěn)定性或感染性上是需要的，VP2 在病毒樣空顆粒的裝配中起重要作用，VP3 需要與VP1或VP2 一起完成核定位任務(wù)［2-3］。

目前禽類(lèi)已經(jīng)分離到2 種血清型腺聯(lián)病毒并完成序列測(cè)定，Wang 等報(bào)道分離到1 株血清型禽腺聯(lián)病毒并進(jìn)行了測(cè)序［4］。江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期開(kāi)展了利用三質(zhì)粒制備rAAAV，并以此作為載體傳遞hKLK1 及miRNA，獲得了長(zhǎng)期高效的表達(dá)［5-6］，但是三質(zhì)粒法制備rAAAV 滴度較低，限制了其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用。Urabe 等［7］首次報(bào)道了利用桿狀病毒與昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)制備rAAV，滴度高，且性質(zhì)與傳統(tǒng)三質(zhì)粒法制備的rAAV 沒(méi)有區(qū)別，但是目前還沒(méi)有桿狀病毒系統(tǒng)制備rAAAV 的研究。為研究在昆蟲(chóng)細(xì)胞中制備rAAAV，首先必須在昆蟲(chóng)細(xì)胞中成功表達(dá)其結(jié)構(gòu)基因，本研究利用Bac-to-Bac 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)3 個(gè)VP 蛋白質(zhì)，為利用桿狀病毒系統(tǒng)研制重組禽腺聯(lián)病毒載體奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、載體和菌株

Sf9 細(xì)胞、含AAAV 全基因組的重組質(zhì)粒pCRAAAV、大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞均由江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供;桿狀病毒Bac-to-Bac 表達(dá)系統(tǒng)(包括轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pFastBac1、E.coliDH10Bac 受體菌)購(gòu)自Invitrogen 公司。

1.2 工具酶和試劑

pfuDNA Polymerase、限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ、NotⅠ及T4DNA 連接酶購(gòu)自Fermentas 公司;Wizard DNA Clean-up System 購(gòu)自美國(guó)Promega 公司;昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基Sf-900ⅡSFM (Serum free medium)購(gòu)自GBICO公司;轉(zhuǎn)染試劑CellfectinⅡReagent 購(gòu)自Invitrogen 公司;HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank 中登錄的AAAV 的基因序列設(shè)計(jì)1 對(duì)引物擴(kuò)增VP基因，在VP引物的上、下游5'端分別添加了NotI 和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)。通用引物M13F/M13R 參照Bac-to-Bac 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)設(shè)計(jì)，引物均由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。引物序列為:VP上游引物:5'-CATGCGGCCGCCACGGCTCTTATTTCTGACGCGATACCCGATTGGTTG-'3(下劃線為NotI 酶切位點(diǎn)，斜體表示突變的位點(diǎn))，VP下游引物:5'-CGTAAGCTTTTACAGCGGTTTGGTGAGGTAACGGGTACCG-' 3 (下劃線為Hind Ⅲ酶切位點(diǎn))。通用引物序列為:M13 上游引物:5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-'3，M13 下游引物:5'-CAGGAAACAGCTATGAC-'3。

1.4 VP 基因的擴(kuò)增

反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s ，72 ℃延伸2 min，反應(yīng)進(jìn)行30 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳，按Wizard DNA Clean-up System 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行純化回收目的基因，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 重組轉(zhuǎn)座載體pFastBac-VP 的構(gòu)建

回收的VP基因經(jīng)NotI 和Hind Ⅲ酶切后，與經(jīng)同樣酶切的pFastBac1 連接，在含100 μg/ml 氨芐青霉素的LB 瓊脂平板上37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜后，挑取單菌落，提取質(zhì)粒電泳篩選，并進(jìn)行酶切鑒定。酶切鑒定正確后送由上海生工生物工程公司測(cè)序，鑒定正確的克隆命名為pFastBac-VP。

1.6 重組桿狀病毒穿梭載體的構(gòu)建

參考Invitrogen 公司的Bac-to-Bac Baculovirus Expression System 使用說(shuō)明，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒pFast-BacDual-Rep 轉(zhuǎn)化DH10Bac 感受態(tài)細(xì)胞，用四環(huán)素(10 μg/ml)、卡那霉素(50 μg/ml)、慶大霉素(7 μg/ml)、IPTG(40 μg/ml)、X-gal(100 μg/ml)LB瓊脂平板篩選白色陽(yáng)性菌落，挑取白色菌落，提取質(zhì)粒，用M13 上、下游引物進(jìn)行PCR 鑒定，擴(kuò)增條件如下:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，反應(yīng)進(jìn)行30 個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸10 min。產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得的陽(yáng)性重組轉(zhuǎn)座子命名為rBacmid-VP。

1.7 重組桿狀病毒rBac-VP 的制備

將rBacmid-VP參照Cellfectin ⅡReagent 轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Sf 9 昆蟲(chóng)細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后每隔12 h 觀察1 次細(xì)胞，直至細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病變，收集上清液，500g離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的無(wú)菌管中，此即為P1 代rBac-VP，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 VP 基因的表達(dá)與鑒定

將P1 代rBac-VP按感染復(fù)數(shù)(MOI)為0.1 感染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Sf9 細(xì)胞，直至細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變(感染后約48 ～72 h)，收集上清液即為P2 代重組病毒，按此方法將病毒傳至P3 代。將P3 代rBac-VP分別按MOI 為1、5 和10 接種24 孔板中Sf9 細(xì)胞，分別在感染后24 h、48 h、72 h 收集細(xì)胞沉淀，PBS 洗滌一次后，于沉淀中加入100 μl 1×Loading buffer 煮沸3 min后，取15 μl 進(jìn)行SDS-PAGE 分析，以未接種病毒的細(xì)胞沉淀作為陰性對(duì)照。樣品電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)印PVDF膜，以鼠抗VP3 多抗作為一抗，以HRP 標(biāo)記的羊抗鼠作為二抗，按常規(guī)方法進(jìn)行Western blot 反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 VP 基因的擴(kuò)增

以VP上、下游引物擴(kuò)增VP基因，產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)大約 2 200 bp 條帶(圖1)，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1 目的基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplified products of target genes by PCR

2.2 重組轉(zhuǎn)座載體pFastBac-VP 的構(gòu)建與鑒定

VP基因回收后用SalI 和NotI 酶切，與經(jīng)同樣酶切的pFastBac1 連接，獲得重組轉(zhuǎn)座載體pFast-Bac-VP。經(jīng)NotI 和Hind Ⅲ酶切出約2 200 bp和4 800 bp 2 條帶(圖2)，與預(yù)期相符，且DNA 測(cè)序證明VP基因克隆正確且無(wú)突變。

2.3 重組桿狀病毒穿梭載體的鑒定

以構(gòu)建的重組穿梭載體rBacmid-VP為模板，以M13 上、下游引物分別進(jìn)行PCR 鑒定，產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳后在4 500 bp 處可見(jiàn)特異性條帶，與預(yù)期片段大小相符(圖3)，表明VP基因轉(zhuǎn)座成功。

2.4 重組桿狀病毒的收獲及感染細(xì)胞的病變

rBacmid-VP轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Sf9 細(xì)胞，5 d 后可見(jiàn)明顯的細(xì)胞病變現(xiàn)象:細(xì)胞變大，細(xì)胞生長(zhǎng)停止，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)顆粒，有些細(xì)胞腫大而破碎，而未轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞未出現(xiàn)此現(xiàn)象。

圖2 重組質(zhì)粒pFastBac-VP 的酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pFastBac-VP by restriction endonucleases digestion

圖3 重組轉(zhuǎn)座子的PCR 鑒定Fig.3 Identification of recombinant transponson by PCR

2.5 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE 分析

將P3 代rBac-VP感染24 孔板中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf9 細(xì)胞，細(xì)胞沉淀進(jìn)行SDS-PAGE 分析，結(jié)果顯示，在分子量約為87 000、73 000 和62 000 處分別出現(xiàn)3 條特異性條帶，比例約為1 ∶1 ∶10(圖4)。

2.6 重組蛋白質(zhì)的Western blot 鑒定

重組蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE 電泳后，采用鼠抗VP3 多抗為一抗進(jìn)行Western blot 檢測(cè)，結(jié)果在87 000、73 000 和62 000 處分別出現(xiàn)特異條帶(圖5)，分子量與目的蛋白質(zhì)相同，而正常Sf9 細(xì)胞未出現(xiàn)相應(yīng)條帶，說(shuō)明重組蛋白質(zhì)在昆蟲(chóng)細(xì)胞中獲得了成功表達(dá)，且具備良好的反應(yīng)原性。

3 討論

腺聯(lián)病毒(Adeno-associated virus，AAV)又稱腺病毒相關(guān)病毒，作為一種新型的病毒載體，具有對(duì)宿主沒(méi)有致病性、免疫原性極低、宿主范圍廣等優(yōu)點(diǎn)［8］，因此被認(rèn)為是一種比較理想的基因轉(zhuǎn)移載體，廣泛地用于基因治療和基因工程疫苗等方面的研究［9-12］。禽腺聯(lián)病毒(Avian adeno-associated virus，AAAV)的理化性質(zhì)、基因組結(jié)構(gòu)等與AAV 基本相似，提示可作為有潛力的重組病毒載體開(kāi)發(fā)應(yīng)用。

圖4 重組蛋白質(zhì)的SDS-PAGE 分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant protein

圖5 重組蛋白質(zhì)的Western blot 鑒定Fig.5 Western blot identification of recombinant protein

由于AAV 是一種復(fù)制缺陷型病毒，在制備rAAV 需要輔助質(zhì)?；蛘咻o助病毒的幫助，且傳統(tǒng)的制備方法滴度低、不能擴(kuò)增，一直制約著rAAV 的基礎(chǔ)與臨床應(yīng)用［13］。桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是一種常用的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，且桿狀病毒同樣可以像腺病毒或單純皰疹病毒一樣為AAV 的復(fù)制提供輔助，但不具有腺病毒和單純皰疹病毒對(duì)人體的毒性，且病毒顆粒大，與AAV 病毒顆粒差異顯著，便于rAAV 的分離純化。因此利用桿狀病毒與昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)制備rAAV 的研究也越來(lái)越多［14-15］，但是應(yīng)用昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)制備rAAAV 的研究卻還沒(méi)有報(bào)道。

Cap基因編碼AAAV 的3 個(gè)結(jié)構(gòu)基因，通過(guò)內(nèi)含子不同強(qiáng)弱的剪切信號(hào)及強(qiáng)弱起始密碼子的選擇翻譯形成3 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)VP1、VP2 和VP3，在AAAV 成熟病毒粒子中3 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的比例約為1 ∶1 ∶10。為研究利用昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)制備rAAAV，首先必須在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)出比例合適的3 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，由于桿狀病毒與昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)不一定能識(shí)別rAAAV 的內(nèi)含子剪切信號(hào)，所以不能直接將含有剪切信號(hào)的Cap基因克隆于桿狀病毒載體中。為了在桿狀病毒系統(tǒng)中表達(dá)出比例合適的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，本試驗(yàn)將VP1起始密碼子周?chē)蛄羞M(jìn)行了突變，將VP1起始密碼子ATG 突變?yōu)槿跗鹗济艽a子ACG，并將其置于強(qiáng)Kozak 序列(ACCAUGG)中，并將其后的ATG 突變?yōu)锳CG，同時(shí)將剪切信號(hào)序列突變掉。VP2起始密碼子為弱起始密碼子ACG，同樣位于強(qiáng)Kozak 序列中，而VP3起始密碼子為強(qiáng)起始密碼子ATG。SDS-PAGE 及Western blot 結(jié)果表明3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)均獲得了成功表達(dá)，分子量正確，具有良好的免疫活性，且比例與預(yù)期相符。

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