于建寧， 潘偉芹， 王公金， 徐小波， 李 燕， 于峰祥

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，江蘇 南京210014;2.南京師范大學(xué)醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210097)

隨著畜牧產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，養(yǎng)殖場規(guī)模的不斷擴(kuò)大，畜禽糞便產(chǎn)生的廢氣(H2S、NH3等)已經(jīng)成為不容忽視的空氣污染源，如何使這些廢氣無害化是保證環(huán)境友好型養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的必要條件之一。然而，目前只能采用吸附法、焚燒法或使用除臭劑等，這些方法一定程度上降低了廢氣對環(huán)境的污染，但還不能做到無害化。所以探求一種廢氣無害化處理方案很有必要。

硫化物-醌氧化還原酶［1］(SQR)是一種黃素蛋白質(zhì)，存在于一些必須依靠硫化物作為氫供體生長的光合化能自養(yǎng)菌中，SQR在藍(lán)細(xì)菌、顫藻屬和光合細(xì)菌莢膜紅桿菌中已被深入研究，發(fā)現(xiàn)其具有分解硫化氫為厭氧光合細(xì)菌提供氫的特征［2-3］。乳酸菌是人和動(dòng)物腸道中極為重要的益生菌，隨著乳酸菌的各種表達(dá)調(diào)控元件的成功分離，使得乳酸菌成為較理想的轉(zhuǎn)基因工程受體菌［4-10］?？剐曰騈isⅠ作為篩選標(biāo)記篩選乳酸乳球菌轉(zhuǎn)化子是最早研究的乳酸菌食品級抗性篩選標(biāo)記系統(tǒng)。芬蘭赫爾辛基大學(xué)Takala 等［11］在2002 年構(gòu)建了食品級克隆載體pLEB590，整個(gè)載體全部由乳酸乳球菌的片斷構(gòu)成:pSH71 復(fù)制子、NisⅠ基因、組成型啟動(dòng)子P45(控制NisⅠ的表達(dá))，將此載體電轉(zhuǎn)化乳酸鏈球菌素(Nisin)敏感的乳酸乳球菌MGl614，以60 IU/ml 的nisin作為篩選濃度，1 μg DNA 可以得到105 個(gè)轉(zhuǎn)化子，且在nisin 的選擇壓力下，pLEB590 可以在乳酸乳球菌MGl614 穩(wěn)定存在。同時(shí)食品級表達(dá)載體pLEB590 已經(jīng)成功地電轉(zhuǎn)化入帶有多個(gè)隱蔽型質(zhì)粒的發(fā)酵干酪工業(yè)菌株(Lactobacillus casei)，而且應(yīng)用此載體已經(jīng)成功地在植物乳桿菌中表達(dá)了來自瑞士乳桿菌(Lactobacillus brevis)的脯氨酸亞氨基肽酶基因(pepI)［11］。這些研究結(jié)果表明，載體pLEB590 可以應(yīng)用于食品級表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)外源基因以應(yīng)用于食品工業(yè)。

本研究擬構(gòu)建攜帶SQR基因的重組表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)入乳酸菌，鑒定其表達(dá)SQR的功能，為下一步開展SQR轉(zhuǎn)基因乳酸菌微生態(tài)制劑的研制，以及有效解決畜禽養(yǎng)殖過程中H2S 等硫化物的排放問題提供關(guān)鍵技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大腸桿菌DH5a、乳酸乳球菌MG1363(Lactococcus LactisMG1363)、表達(dá)載體pMG36e 與質(zhì)粒pcDNA3.1-SQR-Myc均由本實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌DH5a 培養(yǎng)采用LB 培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng);乳酸菌MG1363 采用GM17 培養(yǎng)基，30 ℃靜止培養(yǎng)。紅霉素在大腸桿菌DH5a 和乳酸菌MG1363 培養(yǎng)中的濃度分別是250 μg/ml 和10 μg/ml。

T4 DNA 連接酶、DL5000 Marker、限制性內(nèi)切酶、膠回收試劑盒及PCR 相關(guān)試劑均購自大連Takara 公司，電擊杯為Bio-Rad 產(chǎn)品?？筂yc 的小鼠一抗、辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗小鼠二抗購于天根公司。SDS-PAGE 所需生化試劑均購自上海生工公司。

1.2 重組質(zhì)粒pLEB590-SQR 的構(gòu)建

1.2.1SQR基因的擴(kuò)增 提取質(zhì)粒pcDNA3.1-

SQR:將本實(shí)驗(yàn)室保存的pcDNA3.1-SQR菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，按照常規(guī)方法快速提取質(zhì)粒備用。PCR 擴(kuò)增SQR片段:上游引物序列P1 為5'-CGGGATC CAAGTAGAAGATGGCTCATATCG-3'， 下 劃 線 部 分為BamH I 酶切位點(diǎn)，下游引物P2 為5'-GCTCTAGAGGCACAGTCGAGGCTGAT-3'，下劃線部分為XbaI酶切位點(diǎn)，PCR 反應(yīng)為50 μl 反應(yīng)體系。

1.2.2 回收的SQR片段TA 克隆至T 載體 對PCR 擴(kuò)增片段回收產(chǎn)物(SQR片段)進(jìn)行3'端加A反應(yīng)，72 ℃保溫10 min。在離心管中配制DNA 溶液(pMD18-T 1 μl，DNA 2 μl，溶液I 5 μl，雙蒸水2 μl)，16 ℃反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后將上述10 μl溶液全部加入至感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置10 min。42 ℃熱激45 s 后，再在冰上放置1 min。加入890 μl 培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)60 min。在含有X-Gal、IPTG、Amp 的瓊脂平板培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)過夜。

1.2.3 pMD18-T-SQR的鑒定 挑取單克隆菌株于3 ml 試管搖菌過夜，小量提取質(zhì)粒進(jìn)行XbaI 與BamH I 雙酶切鑒定，37 ℃作用1 h，反應(yīng)結(jié)束后，取5 μl 反應(yīng)產(chǎn)物在1 %瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳觀察。

1.2.4 表達(dá)載體pLEB590 的大量提取 根據(jù)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南［12］，并參考質(zhì)粒大量提取試劑盒(天根公司)說明書，進(jìn)行操作，獲得的質(zhì)粒保存于雙蒸水中。

1.2.5BamHI 和XbaI 酶切載體pLEB590 和回收的PCR 產(chǎn)物 pLEB590 酶切體系如下:pLEB590 5.0 μl，XbaI、BamH I 各1.0 μl，10 倍緩沖液1.5 μl，雙蒸水21.5 μl，共計(jì)30.0 μl。PCR 產(chǎn)物SQR酶切體系如下:SQR5.0 μl，XbaI、BamH I 各1.0 μl，10 倍緩沖液1.5 μl，雙蒸水21.5 μl，共計(jì)30.0 μl。

1.2.6 膠回收載體pLEB590 和目的片段SQR按照膠回收試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.7 載體pLEB590 與SQR連接 根據(jù)測定的回收載體pLEB590 和目的片段SQR的濃度，將載體與目的片段按一定比例連接，即pLEB590 10 μl，SQR5 μl，10 倍T4 DNA 連接酶緩沖液2 μl，T4 DNA 連接酶1 μl，雙蒸水2 μl，共計(jì)20 μl 反應(yīng)體系。

1.2.8 連接產(chǎn)物純化 將數(shù)個(gè)連接反應(yīng)管中的反應(yīng)液合并至一個(gè)管內(nèi)，加入3 倍體積的PCR-A 緩沖液;混勻后轉(zhuǎn)移到制備管中，12 000g離心1 min，棄濾液。將制備管置回2 ml 離心管，加700 μl 緩沖液W2，12 000g離心1 min，棄濾液;加400 μl 緩沖液W2，12 000g離心1 min。將制備管置于潔凈的1.5 ml 離心管中，在制備管中央加 25 ～30 μl 雙蒸水，室溫靜置1 min，12 000g離心1 min 洗脫DNA。

1.3 重組質(zhì)粒pLEB590-SQR 在乳酸乳球菌中的表達(dá)

1.3.1 乳酸乳球菌的感受態(tài)制備 挑取乳酸乳球菌MG1363 單菌落，在3 ml GM17 培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)物按5 %接種量加入到含1 %甘氨酸的SGM17 培養(yǎng)基中，30 ℃培育6 h(OD值約為0.8)。冰浴使細(xì)菌停止生長，4 ℃ 5 000g離心10 min，棄上清，用冰預(yù)冷的洗滌液洗3 次，以去除培養(yǎng)基中的離子成份。用冰冷的原體積5 %電擊緩沖液重懸菌體，放置10 min，每管100 μl 分裝。

1.3.2 乳酸菌的電擊轉(zhuǎn)化 取10 μl 純化連接產(chǎn)物與感受態(tài)MG1363 混合，冰浴10 min，電擊。電擊參數(shù)如下:電壓2 kV，電容25 μF，電阻400 Ω。30℃復(fù)蘇培養(yǎng)2 ～3 h 后，將其涂布在含有40 IU/ml Nisin 的GM17 平板上，培養(yǎng)1 ～2 d。

1.3.3 重組質(zhì)粒鑒定 雙酶切鑒定:挑取單菌落進(jìn)行液體擴(kuò)培，利用質(zhì)粒小提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取。隨后進(jìn)行重組質(zhì)粒XbaI 與BamH I 雙酶切，30 ℃作用30 min 后，37 ℃水浴作用1 h。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μl 反應(yīng)產(chǎn)物于1 %瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳觀察鑒定。重組質(zhì)粒PCR 鑒定:根據(jù)SQR序列設(shè)計(jì)引物P3 與P4，P3 為5'-GGTTTGGGCGGTGCCATCAT-3'，P4 為5'-CCCTTCTTCACGGCCTTCAGC-3'。PCR 反應(yīng)體系為:Taq酶預(yù)混液12.5 μl，上下游引物各0.5 μl，重組質(zhì)粒1.0 μl，雙蒸水10.5 μl，共計(jì)25.0 μl。反應(yīng)結(jié)束后取3 μl PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖電泳。

1.3.4 重組質(zhì)粒pLEB590-SQR-MG1363 質(zhì)粒遺傳穩(wěn)定性檢測

1.3.4.1 pLEB590-SQR-MG1363 生長遲滯期及世代時(shí)間的測定 取1 ml 菌液于100 ml GM17 培養(yǎng)基中混勻，分裝于10 ml 試管中，每個(gè)試管2 ml，30 ℃靜置培養(yǎng)。每1 h 取3 個(gè)試管測菌液OD600值，并將菌液稀釋一定倍數(shù)，接種于GM17 平板，30℃培養(yǎng)24 h，計(jì)算活菌數(shù)(CFU/ml)。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，所測菌液OD600值為縱坐標(biāo)繪制pLEB590-SQR-MG1363 生長曲線圖。取對數(shù)生長期中的一段按以下公式計(jì)算世代時(shí)間，G=(t1-t0)ln2/(lnxlnx0)，式中G為世代時(shí)間，t1為培養(yǎng)時(shí)間，t0初始培養(yǎng)時(shí)間，x0為開始時(shí)的活菌數(shù)，x為經(jīng)t時(shí)間培養(yǎng)后的活菌數(shù)。

1.3.4.2 pLEB590-SQR-MG1363 遺傳穩(wěn)定性測定從不含nisin 的平板上選取100 個(gè)單菌落點(diǎn)種于含nisin 的平板上，最后長出的菌落數(shù)即為質(zhì)粒穩(wěn)定率。具體測定過程如下:從原代菌株平皿挑取單菌落于含40 IU/ml nisin GM17 的GM17 液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜。第2 d 按1 %的接種量接種于含nisin 和不含nisin 的GM17 液體培養(yǎng)基中30 ℃靜置培養(yǎng)。每隔10 代(9 h)轉(zhuǎn)管，獲得不同代數(shù)的菌液。分別取10 ～150 代的菌液適量按一定倍數(shù)稀釋后，涂布于不含nisin 的GM17 平板，30 ℃培養(yǎng)24 h。分別挑取100 個(gè)單菌落點(diǎn)種于相應(yīng)含nisin 的平板，30℃培養(yǎng)過夜，計(jì)算工程菌MG1363 在有、無nisin 選擇壓力傳代質(zhì)粒的丟失率。

1.3.5 重組質(zhì)粒pLEB590-SQR在乳酸乳球菌MG1363 中的表達(dá) 收集菌體，用雙蒸水洗2 次，加入終濃度10 mg/ml 溶菌酶100 μl，37 ℃消化30 min。加100 μl 2×上樣緩沖液，100 ℃反應(yīng)5 min，高速離心后用于SDS-PAGE 電泳。Western blot 分析:SDSPAGE 電泳結(jié)束后，取出凝膠。將PVDF 膜在甲醇中浸濕15 s，在雙蒸水中浸泡2 min，然后轉(zhuǎn)移到濕轉(zhuǎn)液中。將在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡的膠與PVDF 膜放入轉(zhuǎn)印夾中，接好轉(zhuǎn)印裝置并將其放入冰水中，300 mA，90 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF 膜放于5%脫脂奶粉中封閉，室溫?fù)u動(dòng)2 h。一抗1 ∶1 000 稀釋過夜，TBST 洗滌10 min，共洗3 次;二抗1 ∶500 稀釋，室溫?fù)u動(dòng)2 h，TBST 洗滌10 min，共洗3 次，ECL 顯色。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pLEB590-SQR 的構(gòu)建

以提取的質(zhì)粒pcDNA3.1-SQR為模板，以引物P3、P4 進(jìn)行PCR 反應(yīng)，擴(kuò)增得到大約1 400 bp 片段(圖1)，與預(yù)期片段長度相符。

將PCR 擴(kuò)增到的SQR基因片段與pMD18-T-載體連接后轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，在含有Amp、IPTG 和X-gal 的LB 平板上進(jìn)行藍(lán)白篩選，含有插入目的片段的轉(zhuǎn)化子呈現(xiàn)白色菌落，只轉(zhuǎn)入空載體的大腸桿菌呈現(xiàn)藍(lán)色，隨機(jī)挑取幾個(gè)白色菌落接種到5 ml LB液體培養(yǎng)基(100 μg/ml Amp)，37 ℃培養(yǎng)過夜后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。如圖2 所示，可見已經(jīng)成功將SQR片段連接入pMD18-T 載體中。

圖1 PCR 擴(kuò)增SQR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of SQR amplified by PCR

圖2 pMD18-T-SQR 質(zhì)粒酶切電泳圖Fig.2 Electrophoresis of pMD18-T-SQR digested by enzymes

圖3 pLEB590-SQR 雙酶切鑒定Fig.3 Identification of pLEB590-SQR digested with two enzymes

圖4 pLEB590-SQR PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.4 PCR amplification of PLEB590-SQR

2.2 重組質(zhì)粒pLEB590-SQR 在乳酸乳球菌MG1363 中的鑒定與表達(dá)

挑取含有40 IU/ml nisin 的GM17 平板上菌落，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。結(jié)果(圖3)顯示，重組質(zhì)粒用BamH I 和XbaI 酶切后得到1 條 3 100 bp 的載體片段和1 個(gè) 1 400 bp 的目的片段。以pLEB590-SQR為模板擴(kuò)增SQR內(nèi)部片段，得到1 200 bp 片段(圖4)。

提取轉(zhuǎn)化前后乳酸乳球菌中的蛋白質(zhì)，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳(圖5)，1 泳道為陰性對照，2、3 泳道為pLEB590-SQR-MG1363 陽性菌株，可見在分子量5.0×104下方有一特異條帶，與SQR基因表達(dá)產(chǎn)物分子量一致，約 4.8×104。提取乳酸菌表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行Western blot 雜交試驗(yàn)(圖6)，1 泳道為MG1363 陰性，無特異條帶，2、3泳道為陽性pMG36e-SQR-MG1363，在分子量5.0×104下方有特異條帶，表明乳酸菌中表達(dá)了目的蛋白質(zhì)SQR(約4.8×104)。

圖5 pLEB590-SQR 表達(dá)蛋白質(zhì)的SDS-PAGE 電泳圖Fig.5 SDS-PAGE of pLEB590-SQR expressed proteins

圖6 Western blot 檢測MG1363 中SQR 的表達(dá)Fig.6 SQR expression in MG1363 detected by Western blot

2.3 乳酸菌遺傳穩(wěn)定性分析

以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、菌數(shù)的OD600值為縱坐標(biāo)繪制pLEB590-SQR-MG1363 的生長曲線(圖7)，從該曲線可以看出pLEB590-SQR-MG1363 的生長延滯期為2 h。再從曲線的對數(shù)生長期段上任取2個(gè)時(shí)間，本次取對數(shù)期的3 h、5 h 菌液按 10-7～10-8稀釋菌液涂板，得出3 h 菌落數(shù)為 6×108CFU/ml，5 h 菌落數(shù)為4.2×109CFU/ml。根據(jù)公式G=(t1-t0)ln2/(lnx-lnx0)計(jì)算世代時(shí)間G=43 min。由以上結(jié)果可得出pLEB590-SQR-MG1363 從開始培養(yǎng)到傳代10 次所需要的時(shí)間為:10G+t1=9 h。

圖7 乳酸菌pLEB590-SQR-MG1363 生長曲線圖Fig.7 The growth curve of pLEB590-SQR-MG1363

將pLEB590-SQR質(zhì)粒的乳酸乳球菌MG1363連續(xù)培養(yǎng)150 代，在有、無nisin 選擇壓力下質(zhì)粒穩(wěn)定率都在91 %以上(圖8)。結(jié)果表明，pLEB590-SQR在乳酸乳球菌MG1363 中具有較好的遺傳穩(wěn)定性，并且穩(wěn)定性不受nisin 影響。

圖8 pLEB590-SQR-MG1363 在有、無選擇壓力下的遺傳穩(wěn)定率Fig.8 Genetic stability of pLEB590-SQR in MG1363 with and without nisin

3 討論

近十余年來，國內(nèi)外科學(xué)家對SQR基因的序列結(jié)構(gòu)及其降解硫化物的生物功能進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，取得顯著進(jìn)展。Shütz 等［2］從紅莢膜桿菌中分離純化出SQR，并將SQR基因成功克隆于大腸桿菌，表達(dá)出具有生物酶活性的SQR。Bronstein 等［13］也得到相似的研究結(jié)果。本試驗(yàn)也將SQR成功導(dǎo)入大腸桿菌中并獲得表達(dá)。但由于大腸桿菌還含有一些毒蛋白質(zhì)且容易形成包涵體，表達(dá)產(chǎn)物需要一系列純化復(fù)性過程，再加上大腸桿菌為非食用菌，不利于后期制作微生態(tài)制劑用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。為此，我們利用乳酸菌能夠表達(dá)外源蛋白質(zhì)的特點(diǎn)，在乳酸乳球菌中表達(dá)SQR 蛋白質(zhì)。在我們的前期研究中，已經(jīng)成功構(gòu)建了SQR重組載體pMG36e-SQR［14］，并由此獲得了表達(dá)SQR的乳酸乳球菌MG1363，但需要紅霉素進(jìn)行陽性篩選，對環(huán)境易造成二次污染，因此在本試驗(yàn)中構(gòu)建攜帶食品級抗性篩選標(biāo)記的Nisin質(zhì)粒pLEB590，從SQR質(zhì)粒構(gòu)建到表達(dá)SQR乳酸菌的篩選及SQR在乳酸菌中的穩(wěn)定性幾個(gè)方面研究獲得食品級SQR 乳酸菌。

根據(jù)SDS-PAGE 電泳圖可以看出在5.0×104處有目的蛋白質(zhì)，Western blot 雜交檢測也證實(shí)了SQR在乳酸乳球菌MG1363 中的表達(dá)。Takala 等［11］用pLEB590 在乳酸乳球菌和植物乳桿菌中表達(dá)了來源于瑞士乳桿菌中的pep I基因，其表達(dá)的目的蛋白質(zhì)濃度是原菌株的200 倍。羅立新等［15］將小鼠的mCu/ZnSOD基因與 pLEB590 重組，在宿主菌MG1464 中進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果該基因可以在宿主菌中進(jìn)行活性表達(dá)，但是表達(dá)量較低。pLEB590 載體中目的蛋白質(zhì)與食品級載體啟動(dòng)子相距較遠(yuǎn)，其表達(dá)量與RBS 位點(diǎn)堿基種類、數(shù)量以及與起始密碼子AUG 之間的距離都有很大關(guān)系。本試驗(yàn)SQR表達(dá)量介于兩者之間。蛋白質(zhì)的差異表達(dá)可能與基因以及所用的宿主乳酸菌種類亦有一定的關(guān)系。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，我們已經(jīng)成功獲得了遺傳穩(wěn)定性好的攜帶SQR質(zhì)粒的食品級乳酸乳球菌。汪川等［16］研究結(jié)果表明，質(zhì)粒pMG36e 在有、無紅霉素壓力下在乳酸乳球菌MG1363 中均能保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。范碩等［17］將質(zhì)粒pLEB590 電轉(zhuǎn)入植物乳桿菌Lact2 中，在300 U/ml nisin 的MRS 培養(yǎng)基中連續(xù)轉(zhuǎn)接30 代，提取質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，結(jié)果仍含有質(zhì)粒，說明在有nisin 選擇壓力下，菌株能夠保持外源質(zhì)粒的遺傳穩(wěn)定性;而含有pLEB590 的植物乳桿菌Lact2 在無nisin 的液體MRS 培養(yǎng)基中，連續(xù)培養(yǎng)3代質(zhì)粒丟失，說明在沒有nisin 的壓力下，質(zhì)粒pLEB590 很容易丟失。本試驗(yàn)檢測重組乳酸菌pLEB590-SQR-MG1363 的遺傳穩(wěn)定性，在40 U/ml nisin GM17 培養(yǎng)基中傳代150 次，穩(wěn)定性在96%以上，在無nisin 的選擇壓力下質(zhì)粒保持其遺傳穩(wěn)定性91%，說明乳酸乳球菌MG1363 能夠保持質(zhì)粒遺傳穩(wěn)定性。如何提高SQR在乳酸乳球菌中的表達(dá)量將是以后的研究重點(diǎn)，雖然SQR已經(jīng)成功表達(dá)，但是否具有生物酶活性，能否有效降解畜禽糞便中的硫化物還有待進(jìn)一步研究。

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