陸吉虎， 唐應(yīng)華，3， 田 震， 劉振興， 查國飛， 陳 輝， 侯繼波

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京210014;2.南京天邦生物科技有限公司，江蘇 南京211102;3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京210095;4.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，安徽 合肥230036)

禽流感(Avian influenza，AI)是由正黏病毒科、甲型流感病毒屬的A 型流感病毒引起的一種禽類感染和/或者疾病綜合征［1］。該病主要侵害禽類的呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)等，產(chǎn)生從無癥狀或溫和癥狀到高致病性的感染。其中高致病性禽流感(Highly pathogenetic avian influenza，HPAI)表現(xiàn)為高發(fā)病率和高死亡率的全身感染，HPAI 的每一次流行，都會引起禽的大量死亡和生產(chǎn)性能的急劇下降，造成極大的經(jīng)濟損失。目前使用的禽流感疫苗，主要是以病毒的膜蛋白質(zhì)血凝素(HA)或者神經(jīng)氨酸酶(NA)為關(guān)鍵靶抗原，完全或者主要依靠HA(或NA)誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體。但是禽流感病毒基因中，HA 和NA 基因突變率很高［2-3］，從而導(dǎo)致抗原及致病力的易變異性，針對某一進(jìn)化分支病毒抗原發(fā)展的疫苗對不同進(jìn)化分支的病毒株缺乏有效的中和活性［4］，這加大了禽流感的檢測和防治難度。M2蛋白質(zhì)是禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)中高度保守的蛋白質(zhì)，在AIV 各亞型的不同毒株之間都具有很高的同源性［5-7］，主要以四聚體形式存在于流感病毒粒子表面，能誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答并且具有一定的交叉保護(hù)力［8］，因此是研究交叉保護(hù)性疫苗的理想抗原。而且，M2 的主要保護(hù)性抗原決定簇在M2 的膜外部分，即M2 氨基酸N 端的1 ～24個氨基酸(M2e)［6，9］，M2e 同樣可以誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答［10-11］。本試驗參照流感病毒M2 及HA 的氨基酸序列分別設(shè)計2 條多肽后進(jìn)行人工合成并制成油乳劑疫苗進(jìn)行動物免疫，以期為開發(fā)具有交叉保護(hù)性的禽流感疫苗打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 鏈霉親和素(Streptavidin，SA)為AMRESCO 公司產(chǎn)品;HRP 標(biāo)記羊抗雞IgG 及FITC 標(biāo)記羊抗雞IgG 購自Thermo 公司;DMEM 購自GIBCO

公司，96 孔細(xì)胞板、ELISA 板均為Costar 公司的產(chǎn)品;禽流感病毒H5(H9)亞型血凝抑制試驗抗原(Re-4/Re-6 株)購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司。小牛血清購自杭州四季青生物工程公司;Tween-20、白油、司本-80 等試劑均為國產(chǎn)分析純試劑;PBS 緩沖液，本實驗室配制。

1.1.2 合成肽 根據(jù)文獻(xiàn)報道，參照流感病毒M2及HA 的氨基酸序列設(shè)計2 條多肽，由吉爾生化(上海)有限公司合成。M2e 序列為SLLTEVETHTRN，HA0 序 列 為 ACGLRNSPQRERRRKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVCA。同時合成M2e-biotin、HA0-biotin 多肽。

1.1.3 毒株、細(xì)胞及SPF 雞胚 禽流感H9N2 病毒SD01 株(A/Chinken/ShanDong/01/2011)由本實驗室分離鑒定為禽流感H9N2 病毒;MDCK 細(xì)胞由本實驗室凍存。SPF 雞(雞胚)系用購自北京梅里亞維實驗動物技術(shù)有限公司的SPF 種蛋，由本實驗室孵化，出殼后飼養(yǎng)于隔離器備用。重組禽流感病毒滅活疫苗(H5N1 亞型，Re-6 株)為哈爾濱維科生物技術(shù)公司產(chǎn)品;禽流感(H9 亞型，NJ02 株)滅活疫苗為南京天邦生物科技有限公司有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 多肽疫苗的制備及動物免疫 合成的M2e、HA0 多肽用PBS 溶解后加入4%吐溫-80，然后與白油(含4%司本-80)按照1 ∶3 體積比混合并充分乳化配制成油乳劑疫苗，每羽份(0.3 ml)抗原含量為300 μg。100 只SPF 雞隨機分成5 組，每組20 只，母源抗體血凝抑制(HI)效價降低至2lg2 以下后，采用頸部皮下注射法免疫(對照組用PBS 同法免疫)。隔2 周加強免疫1 次，共免疫3 次。第1 次免疫后每2 周翅靜脈采血(即分別為一免后的第2、4、6、8周采血)并分離血清用于檢測抗體效價。試驗分組及免疫情況見表1。

表1 試驗SPF 雞分組及免疫劑量Table 1 The grouping of SPF chickens and immune doses

1.2.2 免疫血清抗體的檢測 用微量血凝抑制試驗檢測血清抗體的HI 效價。ELISA 檢測免疫血清抗體的方法簡述如下:先用6 μg/ml 鏈霉親和素每孔200 μl 包被ELISA 板，于35 ℃濕盒孵育過夜;再加200 μl 2 μmol/ml 合成抗原Biotin-多肽，37 ℃濕盒孵育1 h，用1%BSA 的PBST(含5%吐溫-20 的PBS 溶液)溶液37 ℃封閉;待檢血清用含0.5%BSA 的PBST 稀釋600 倍，分別加入相應(yīng)孔內(nèi)，37 ℃孵育1 h;每孔加入100 μl 1 ∶20 000 的HRP 標(biāo)記的羊抗雞IgG，37 ℃濕盒反應(yīng)1 h 后，加入現(xiàn)配制的TMB 底物溶液每孔100 μl，37 ℃顯色10 min。每孔加入100 μl 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，讀取吸光值OD450。比較兩種合成肽疫苗免疫后產(chǎn)生的抗體水平。

1.2.3 免疫后血清的病毒中和抗體效價 用固定病毒稀釋血清法，將免疫后血清56 ℃滅活30 min后，用含5 μg/ml TPCK(甲苯磺酰-苯丙氨酸氯甲基酮)胰酶的DMEM 培養(yǎng)液進(jìn)行2 倍倍比稀釋，每個稀釋度分別與2 000TCID50/ml 禽流感H9 亞型SD01 病毒液等體積混合［12］，置37 ℃反應(yīng)1 h 后，按每孔100 μl 接種至鋪成單層MDCK 細(xì)胞的96 孔細(xì)胞板內(nèi)。每一個稀釋度接種4 個重復(fù)孔。同時設(shè)病毒對照(200TCID50)、商品滅活疫苗免疫血清及商品滅活疫苗免疫血清與病毒混合液對照。置37 ℃的5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)120 h，記錄出現(xiàn)CPE(致細(xì)胞病變效應(yīng))孔數(shù)，結(jié)果以3/4 以上細(xì)胞孔未發(fā)生病變的最高稀釋度記為有效中和保護(hù)效價。

1.2.4 間接免疫熒光檢測免疫后血清 用含10%

犢牛血清的DMEM 培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)MDCK 細(xì)胞24 h，棄去上清，加入200TCID50的禽流感H9N2 亞型病毒SD01 株，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 h。棄掉培養(yǎng)液，用PBS (pH 7.4)洗滌3 次，加-20 ℃預(yù)冷的丙酮∶乙醇(6 ∶4)，固定5 min，再用PBS 漂洗3 次后干燥。分別加入用PBS 稀釋50 倍的檢測血清和陰性對照血清，于37 ℃孵育1 h。用PBS 沖洗3 次，加入FITC 標(biāo)記羊抗雞IgG，避光37 ℃反應(yīng)30 min。用PBS 洗滌3 次并風(fēng)干后用熒光顯微鏡觀察，驗證產(chǎn)生的抗M2e/HA0 抗體能否與表達(dá)在感染MDCK 細(xì)胞表面的M2/HA 結(jié)合。

1.2.5 免疫雞攻毒后的排毒檢測 試驗雞第3 次加強免疫后第4 周，對免疫組和對照組均用禽流感病毒H9N2 亞型SD01 株進(jìn)行滴鼻接種病毒，每只雞接種病毒108EID50/ml。攻毒后雞飼養(yǎng)于隔離器中，觀察14 d，記錄試驗雞死亡及發(fā)病情況，同時于攻毒后3 d、5 d、7 d 分別采集喉拭子和肛門拭子。將同一只雞的喉拭子和肛門拭子混合，8 000 r/min離心5 min 后取上清，以每只0.1 ml 接種10 日齡SPF 雞胚5 只，36 ℃繼續(xù)孵化，去除24 h 內(nèi)死亡的雞胚，在120 h 后將所有健活雞胚于4 ℃全部凍死，然后檢測各胚的HA 效價。雞胚尿囊液的血凝價(HA)≥22判為陽性。

2 結(jié)果

2.1 免疫血清抗體滴度

M2e/HA0 多肽苗和H5/H9 亞型滅活苗免疫后血清分別用禽流感病毒H5 亞型和H9 亞型血凝抑制檢測抗原檢測，結(jié)果顯示M2e/HA0 多肽苗組血清均未檢測到HI 抗體，而H5 亞型和H9 亞型滅活苗組免疫后第2 周血清的HI 抗體效價分別為6.49 lg2 和7.06 lg2，第8 周血清的HI 抗體效價分別達(dá)9.15 lg2 和9.78 lg2(表2)。

表2 疫苗免疫后血清的HI 效價Table 2 HI titers of serum antibody following immunization

以血清1 ∶600 稀釋的OD450值作為抗體滴度，分別以合成的M2e-biotin、HA0-biotin 多肽進(jìn)行包被檢測含M2e、HA0 多肽疫苗免疫后血清的抗體效價。以M2e-biotin 包被檢測M2e 多肽及H5 和H9滅活苗免疫組一免后第8 周血清ELISA 抗體效價，分別為0.783、0.223 和0.234(圖1A);以HA0-biotin 包被檢測HA0 多肽及H5 和H9 滅活苗一免疫后第8 周血清的抗體效價，分別為0.767、0.470 和0.365(圖1B)。M2e 和HA0 多肽疫苗免疫后血清的ELISA 抗體效價明顯呈上升趨勢，且都比H9 和H5 滅活苗免疫后血清的效價高(圖1)。

圖1 SPF 雞免疫M(jìn)2e/HA0 多肽苗后血清ELISA 抗體水平Fig.1 ELISA titers of serum antibody in SPF chicken following vaccination with peptide M2e/HA0

2.2 血清的病毒中和抗體效價

免疫后血清的病毒中和抗體效價判定標(biāo)準(zhǔn)為以3/4 細(xì)胞孔未出現(xiàn)病變的最高血清稀釋度作為有效中和效價。禽流感H9 滅活苗首免后第4、6、8 周的血清中和效價最高，分別為1 ∶128、1 ∶256 和1 ∶128。兩種多肽疫苗免疫血清效價在首免后第8 周HA0 組比M2e 組高(分別為1 ∶16 和1 ∶8)，第6周均為1 ∶16。禽流感H5 滅活苗的免疫血清效價遠(yuǎn)低于H9 滅活苗免疫血清的中和效價，也低于M2e/HA0 多肽苗的免疫血清中和效價(表3)。

表3 免疫后血清與SD01 株的中和試驗結(jié)果Table 3 Neutralization test results of immunized chicken serum with strain SD01

2.3 血清抗體間接免疫熒光

如圖2 所示，用禽流感H9N2 亞型病毒SD01株感染MDCK 細(xì)胞與免疫后的血清孵育后再結(jié)合FITC 標(biāo)記抗體，觀察抗原抗體結(jié)合特性，熒光顯微鏡(×10)下觀察。H9 和H5 滅活苗組血清均能在MDCK 的胞內(nèi)產(chǎn)生明亮的熒光顆粒，且H9 滅活苗組含熒光顆粒的MDCK 細(xì)胞約達(dá)到70%左右(圖2A)，H5 滅活苗組血清含熒光顆粒的MDCK 細(xì)胞約50% 左右(圖2B)。多肽苗(M2e/HA0)組含熒光顆粒的MDCK 細(xì)胞僅約20%左右，且熒光亮度較弱(圖2C、圖2D)。陰性血清對照組的細(xì)胞表面沒有熒光(圖2E)。表明免疫血清能夠與病毒表達(dá)在感染細(xì)胞表面的M2 和HA 結(jié)合。

2.4 免疫雞攻毒后排毒檢測

對免疫后試驗雞進(jìn)行攻毒試驗，結(jié)果見表4。M2e 疫苗組與HA0 疫苗組攻毒后第3 d 分別有9 和10 只雞出現(xiàn)排毒情況，第7 d 都有所下降，分別為5只和8 只。H9 亞型滅活苗組攻毒后3 d 出現(xiàn)排毒雞數(shù)量與M2e 疫苗組相當(dāng)，但是7 d 后H9 亞型滅活苗組已經(jīng)無排毒雞。

圖2 間接免疫熒光檢測感染H9 禽流感的MDCK 細(xì)胞與血清反應(yīng)性Fig.2 Fluorescence microscopic observation of the reaction between sera and MDCK cells infected with H9 AIV

表4 禽流感病毒H9N2 亞型SD01 株攻毒后各組雞的排毒情況Table 4 Virus shedding of chicken groups post challenge with H9N2 subtype AIV strain SD01

3 討論

AIV 亞型眾多，變異快，給檢測和防治工作都帶來了困難。長期以來，人們期望能夠發(fā)展通用型禽流感疫苗來達(dá)到一勞永逸的免疫預(yù)防效果。禽流感的外膜蛋白質(zhì)包括HA、NA、M2 三類，其中的HA、NA基因突變率最高，而M2 是高度保守的抗原分子，是發(fā)展通用型疫苗的理想靶抗原［13］。M2e 蛋白質(zhì)可誘導(dǎo)產(chǎn)生交叉保護(hù)抗體［10-11］，Ernst 等［11］用合成的M2e 抗原多肽與佐劑混合后經(jīng)鼻腔免疫小鼠，攻毒能產(chǎn)生明顯的免疫保護(hù);桿狀病毒表達(dá)的M2蛋白質(zhì)也能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫保護(hù)并具有交叉保護(hù)力［14］。尚書文等［15］將M2基因與雞IgG Fc 片段基因相串聯(lián)，在巴斯德畢赤酵母中融合表達(dá)，免疫試驗證明融合蛋白質(zhì)可以誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的抗M2e蛋白質(zhì)抗體。本試驗在對不同亞型禽流感的M2 和HA 氨基酸序列分析比對的基礎(chǔ)上，選擇了部分保守肽段并適當(dāng)優(yōu)化后合成小分子肽段，然后制備成油乳劑疫苗免疫SPF 雞，同時與市售禽流感H5/H9滅活疫苗進(jìn)行對比試驗。以合成M2e-biotin(HA0-biotin)多肽包被ELISA 板分別檢測對應(yīng)多肽疫苗免疫后的血清抗體效價，結(jié)果都比H5 和H9 滅活苗免疫的血清效價高，證明了合成的M2e 和HA0 多肽具有較好的免疫原性，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的抗體。用禽流感H9 亞型SD01 株病毒對免疫后血清測定中和抗體效價，多肽免疫組最高效價為1 ∶16，遠(yuǎn)低于H9 血清中和效價(1 ∶256)，但是都比H5 滅活苗的免疫血清效價高(1 ∶4)，表明合成多肽疫苗具有一定的交叉保護(hù)性。在隨后的攻毒排毒檢測試驗結(jié)果表明，兩個多肽疫苗免疫組都能夠有效地抑制試驗雞攻毒后排毒，其中M2e 免疫組抑制效果略好于HA0 免疫組。多肽抗原是完整病毒的一部分，不具有傳染性并且可以大量生產(chǎn)，是發(fā)展疫苗的途徑之一。早在上個世紀(jì)，Lerener 等［16］就提出了開發(fā)合成肽疫苗的觀點，即先確定天然抗原的氨基酸序列

及抗原決定簇肽段，然后合成抗原肽并驗證合成肽免疫原性，篩選出具有保護(hù)性的抗原肽來制備疫苗。本試驗進(jìn)一步證實了M2e/HA0 多肽具有較好的免疫原性，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性抗體，為開發(fā)通用型禽流感亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。

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