陶志云， 施祖灝， 朱春紅， 宋 遲， 徐文娟， 宋衛(wèi)濤， 李慧芳

(江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇 揚(yáng)州225125)

1989 年，美國免疫學(xué)家Janeway 在冷泉港會(huì)議上提出模式識(shí)別理論，認(rèn)為某些病原體或其產(chǎn)物共有在進(jìn)化上高度保守的特定分子結(jié)構(gòu)，這種高度保守的分子結(jié)構(gòu)稱為病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular pattern，PAMP)［1］。PAMP 能被固有免疫細(xì)胞表面的相應(yīng)受體，即模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptor，PRR)所識(shí)別，并相互作用激活免疫功能。

在高等動(dòng)物中迄今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了三大家族的模式識(shí)別受體(PRR)，分別是Toll 樣受體(TLR)、視黃酸誘導(dǎo)基因樣受體(RLR)和Nod 樣受體(NLR)。目前研究最多的PRRs 是Toll 樣受體(TLRs)，他們位于細(xì)胞表面或內(nèi)涵體中［2］。NOD 樣受體(NODlike receptors，NLRs)是近年來發(fā)現(xiàn)的胞質(zhì)型模式識(shí)別受體(PRRs)［3］，通過識(shí)別病原相關(guān)分子模式(PAMPs)迅速啟動(dòng)先天性免疫，并能通過信號(hào)傳導(dǎo)啟動(dòng)適應(yīng)性免疫，在機(jī)體的免疫防御中發(fā)揮重要作用［4］。已知NLRs 由NOD 亞家族、NALP 亞家族和IPAF 亞家族等成員組成。NALP3 作為NALP 亞家族成員，有研究結(jié)果表明其能識(shí)別多種微生物［5-7］，并且與TLR 受體有協(xié)同作用［8］，在機(jī)體先天性免疫反應(yīng)和疾病發(fā)生過程中具有重要作用［9］。

本試驗(yàn)采用RT-PCR 技術(shù)克隆雞NALP3基因的部分序列，并檢測(cè)雞NALP3基因在其心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺、法氏囊、小腸、輸卵管、卵巢、睪丸和腦12 種組織中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步深入研究雞NALP3基因在禽類先天性免疫中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選擇12 周齡的公、母清遠(yuǎn)麻雞各3 只，解剖后分別采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺、法氏囊、小腸、輸卵管、卵巢、睪丸和腦12 種組織，立即投入液氮中保存?zhèn)溆?。試?yàn)用清遠(yuǎn)麻雞來源于國家級(jí)地方雞種基因庫(江蘇)。

1.2 主要試劑和儀器

TRNzol-A+總RNA 提取試劑(DP421)、Super-RealPreMix(SYBR Green，F(xiàn)P204-01)、Quant cDNA第一鏈合成試劑盒(QuantScript RT Kit，KR103-04)、pGM-T 克隆試劑盒(VT302-02)、質(zhì)粒小提試劑盒(TIAN prep Mini Plasmid Kit，DP103-02)、DNA 產(chǎn)物純化回收試劑盒(TIAN quick Midi Purification Kit，DP204-02)購自TIANGEN 公司;DNA marker DL2000 為TaKaRa 公司產(chǎn)品;瓊脂糖和DEPC 為Promega 公司產(chǎn)品。

熒光定量分析采用Stratagene 公司的Mx3000P型PCR 儀，PCR 儀(Eppendorfmastercycler);凝膠成像系統(tǒng)(Tanon 3500R);紫外分光光度計(jì)(GeneQuant II，Pharmacia Biotech);高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf centrifuge 5417R)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 雞NALP3基因部分cDNA 片段的獲得 采用TRNzol 法提取12 種組織的總RNA;組織總RNA 提取按照TRNzol-A+總RNA 提取試劑的說明書進(jìn)行，提取的RNA 沉淀用適量的DEPC 溶解后，進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)，分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 純度和含量。經(jīng)檢測(cè)合格并定量的總RNA 參照cDNA 第一鏈合成試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。首先根據(jù)GenBank 中已經(jīng)公布的原雞NALP3基因核苷酸預(yù)測(cè)序列(登錄號(hào):XM_001233261.2)，采用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物:上游引物序列5'-ACCGCTACACCAACCTGAC-3';下游引物序列5'-TCCCTTCCACCCACTCCAT-3'，目的序列片段長(zhǎng)度為210 bp。PCR 反應(yīng)體系總體積20 μl，退火溫度60 ℃，72 ℃延伸10 min，35 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、回收純化后與pGM-T 載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(E.coli)TOP10，挑取轉(zhuǎn)化子于含氨芐抗性的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃200 r/min 振搖培養(yǎng)過夜，用PCR 鑒定。鑒定正確的質(zhì)粒的序列測(cè)定及引物序列合成均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.3.2 雞NALP3基因的組織表達(dá)差異分析 采用Real time-PCR 法檢測(cè)雞NALP3mRNA 在各組織中的表達(dá)情況。NALP3熒光定量PCR 引物為:上游引物5'-ACCGCTACACCAACCTGAC-3';下游引物5'-TCCCTTCCACCCACTCCAT-3'，片段長(zhǎng)度為210 bp。內(nèi)參β-actin引物為:上游引物5'-TGCTGTGTTCCCATCTATCG-3';上游引物5'-TTGGTGACAATACCGTGTTCA-3'，片段長(zhǎng)度為150 bp。熒光定量PCR反應(yīng)體系(20.0 μl)如下:cDNA 2.0 μl，2×SYBR real-time PCR premix 10.0 μl，50×ROX reference dye 0.4 μl，上、下游引物各0.8 μl，ddH2O 6.8 μl。40個(gè)循環(huán)(95 ℃，20 s;60 ℃，15 s;72 ℃，15 s)，將cDNA 樣品進(jìn)行2 倍梯度稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，擴(kuò)增后進(jìn)行熔解曲線分析。

用Mx3000P 型PCR 儀分析雞NALP3基因在不同組織中的表達(dá)情況。Real-time PCR 反應(yīng)為:(1)95 ℃15 min;(2)95 ℃20 s，60 ℃15 s，72 ℃15 s，40 個(gè)循環(huán);(3)95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s。每一個(gè)循環(huán)結(jié)束后實(shí)時(shí)測(cè)定熒光值，全部循環(huán)結(jié)束后測(cè)量熔解曲線。按照參考文獻(xiàn)［10］中2-△△Ct方法分析NALP3基因的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 NALP3 基因的中間段cDNA 序列的克隆

采用RT-PCR 的方法獲得條帶單一、明亮的目的片段，經(jīng)測(cè)序?yàn)?10 bp(圖1)，陰性對(duì)照管不加cDNA 模板，未見目的片段。

圖1 NALP3 基因的部分cDNA 片段Fig.1 The partial cDNA fragment of NALP3 gene

2.2 Real-time PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線、擴(kuò)增曲線和熔解曲線

將cDNA 樣品進(jìn)行2 倍梯度稀釋后，將2 種標(biāo)準(zhǔn)品在同一試驗(yàn)中運(yùn)行，進(jìn)行NALP3和β-actin基因的定量PCR 反應(yīng)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為:Y=-3.425 lgx+33.34 和Y=-3.486 lgx+23.95。曲線擬合度(R2)分別達(dá)到了0.998 和1.000，說明具有非常好的線性關(guān)系，擴(kuò)增效率分別為104.6% 和102.8%，擴(kuò)增效率相對(duì)偏差小于5.0%，可以進(jìn)行準(zhǔn)確的定量。熔解曲線峰形單一，說明反應(yīng)特異性好，符合SYBR Green 染料的檢出要求。2 個(gè)基因的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物均具有相同的峰值，重復(fù)性好，且無引物二聚體和非特異性峰的存在，說明產(chǎn)物的特異性較好，達(dá)到了熒光定量的要求(圖2)。

2.3 雞NALP3 基因在雞不同組織中的表達(dá)

以β-actin為內(nèi)參照基因，采用相對(duì)定量的方法對(duì)雞NALP3基因在雞體內(nèi)各組織中的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果(圖3)顯示，雞NALP3基因在所檢測(cè)的12種組織中均有表達(dá)，以小腸作為對(duì)照，表達(dá)量定為1，其他各組織中的表達(dá)量分別為:心臟13.30、胸腺11.82、法氏囊7.13、腦2.25、睪丸8.26、肝臟1.16、脾臟2.08、卵巢2.22、腎臟3.26、輸卵管3.27 和肺臟5.06，在心臟中的表達(dá)量最高，小腸中的表達(dá)量最低。

圖2 NALP3 和β-actin 的標(biāo)準(zhǔn)曲線、擴(kuò)增曲線和熔解曲線Fig.2 Standard curve，amplification plots and dissociation curve of NALP3 and β-actin genes by real-time PCR

圖3 雞NALP3 基因在各組織中的相對(duì)表達(dá)情況Fig.3 The relative expression level of NALP3 gene in various organs of chicken

3 討論

NALP3是NLR 受體家族的重要成員，具有重要生理意義，一旦突變會(huì)引起人類很多疾病，如寒冷誘導(dǎo)的自發(fā)性炎癥綜合征［8］。有關(guān)NALP3基因已有較多研究［9，11-12］，取得了很多研究進(jìn)展［13］，但主要集中于人和小鼠，尚未見在禽類中的研究報(bào)道。

不同細(xì)胞、不同組織在生命活動(dòng)中起到不同的作用，對(duì)某一基因在細(xì)胞水平或組織水平的表達(dá)分布特征以及在整個(gè)生命周期中表達(dá)時(shí)序性特征的研究，能夠?yàn)榛虻墓δ芊治鎏峁﹨⒖?。目前已知NALP3主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞和外周血白細(xì)胞［6］，但在組織中的分布情況尚不清楚，因此本文采用反轉(zhuǎn)錄PCR 技術(shù)克隆雞NALP3基因的部分cDNA 片段，并采用熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)雞12 種組織中NALP3基因的相對(duì)表達(dá)水平，從轉(zhuǎn)錄水平研究NALP3基因的組織分布情況。

曾有研究檢測(cè)了人的血液、骨髓、脈管、心臟、腦、淋巴結(jié)、胰腺、胎盤、脾臟、胸腺和氣管等11 種組織中NALP3基因表達(dá)情況，結(jié)果表明，在骨髓和胸腺中高表達(dá)，在血液、腦、胰腺中表達(dá)量相對(duì)較低，在其他幾種組織中沒有檢測(cè)到NALP3表達(dá)［14］。本試驗(yàn)采用熒光定量PCR 方法，檢測(cè)雞NALP3mRNA在雞體內(nèi)各組織中的表達(dá)水平，結(jié)果表明，NALP3基因在12 種組織中均有表達(dá)，但表達(dá)水平存在差異，在所檢測(cè)的3 個(gè)免疫器官中，胸腺和法氏囊表達(dá)量很高，但脾臟中表達(dá)量較低，說明NALP3中樞免疫器官中可能發(fā)揮更重要作用。在具有性別特征的器官中，睪丸中表達(dá)量很高，而輸卵管和卵巢中表達(dá)量較低，提示NALP3基因的表達(dá)可能與性別有關(guān)。另外，在所檢測(cè)的12 種組織中，NALP3在心臟中表達(dá)量最高，小腸中表達(dá)量最低。我們的結(jié)果與在人中的研究結(jié)果［14］有部分一致(胸腺中高表達(dá)，腦中低表達(dá))，但我們檢測(cè)到NALP3在雞心臟中高表達(dá)，而在人心臟中卻未被檢測(cè)到，結(jié)果不一致，這可能與組織的來源和年齡等有關(guān)，提示NALP3的表達(dá)可能有時(shí)間和物種差異，這種差異還需做進(jìn)一步驗(yàn)證?？傊琋ALP3基因在雞體各組織中廣泛表達(dá)，表明雞NALP3基因可能在雞體內(nèi)發(fā)揮重要的作用。

［1］ JANEWAY C A.Approaching the asymptote?Evolution and revolution in immunology［J］.Cold Spring Harb Symp Quant Biol，1989，54(1):1-13.

［2］ UEMATSU S，AKIRA S.Innate immune recognition of viral infection［J］.Uirusu，2006，56(1):1-8.

［3］ INOHARA C，MCDONALD C.NOD-LRR proteins:role in hostmicrobial interactions and inflammatory disease［J］.Annu Rev Biochem，2005，74:355-383.

［4］ KAWAI T，AKIRA S.The roles of TLRs，RLRs and NLRs in pathogen recognition［J］.Int Immunol，2009，21(4):317-337.

［5］ MCINTIRE C R，YERETSSIAN G，SALEH M.Inflammasomes in infection and inflammation［J］.Apoptosis，2009，14(4):522-535.

［6］ 曹雪濤.免疫學(xué)前沿進(jìn)展［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2009:149-152.

［7］ FRANCHI L，WARNER N，VIANI K，et al.Function of Nod-like receptors in microbial recognition and host defense［J］.Immunol Rev，2009，227(1):106-128.

［8］ VERMA D，ERIKSSON P，SAHDO B，et al.Two adult siblings with atypical cryopyrin-associated periodic syndrome due to a novel M299V mutation in NLRP3［J］.Arthritis Rheum，2010，62(7):2138-2143.

［9］ GASSE P，RITEAU N，CHARRON S，et al.Uric acid is a danger signal activating NALP3 inflammasome in lung injury inflammation and fibrosis［J］.Am J Respir Crit Care Med，2009，79(10):903-913.

［10］ LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))Method［J］.Methods，2001，25(4):402-408.

［11］ BLOMGRAN R，PATCHA B V，VERMA D，et al.Common genetic variations in the NALP3 inflammasome are associated with delayed apoptosis of human neutrophils［J］.PLoS One，2012，7(3):e31326.

［12］ ZHU P，DUAN L，CHEN J，et al.Gene silencing of NALP3 protects against liver ischemia-reperfusion injury in mice［J］.Hum Gene Ther，2011，22(7):853-864.

［13］ 毛開睿，孫 兵.NLRP3 炎性小體研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代免疫學(xué)，2011，31(1):1-4.

［14］ YIN Y，YAN Y，JIANG X，et al.Inflammasomes are differentially expressed in cardiovascular and other tissues［J］.Int J Immunopathol Pharmacol，2009，22(2):311-322.