劉龍騰， 賈春旸， 努爾力·阿不力孜， 張文祥， 趙宗勝

(石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆 石河子832003)

在現(xiàn)代動物育種中，由于要利用各種親屬的表型信息，準(zhǔn)確的系譜記錄十分重要，然而在有些情況下，不能準(zhǔn)確地確認(rèn)某些個體的父本，不能準(zhǔn)確地判斷個體的親緣關(guān)系，從而影響綿羊育種工作的順利開展。因此對家畜特別是種公畜的系譜確證就顯得更為重要。

用微衛(wèi)星DNA 進(jìn)行親子鑒定是一新興的生物技術(shù)，在國內(nèi)外多種家畜和動物上做過試驗并取得較好的結(jié)果。Glowatek-Mullis 等［1］用分屬不同染色體的多態(tài)微衛(wèi)星位點成功解決了以前用血型無法解決的35 頭牛的血緣控制問題。Fredholm 等［2］用6 ～9 個分屬不同染色體的多態(tài)微衛(wèi)星位點鑒定了來源于12 個品種狗的血緣，此外還利用微衛(wèi)星位點對一個有爭議的母本進(jìn)行了確認(rèn)(概率99.99%)。Hygen 等［3］對用微衛(wèi)星位點進(jìn)行血緣鑒定進(jìn)行了評估，使用分屬7 條染色體的22 條微衛(wèi)星在牛群中分2 種情況計算排除概率，在被懷疑個體基因型未知時排除概率大于 0.998 6，被懷疑者基因型已知時排除概率大于0.999 9。Luikart 等［4］用分屬16 條染色體上22 個微衛(wèi)星位點對山羊進(jìn)行親子鑒定，結(jié)果表明在開士米山羊、安哥拉山羊和薩能山羊中排除概率分別為:大于0.999 999、大于0.999 99、大于0.999 9，同時證明兩個個體完全相同的概率為1×10-15。

本試驗采用微衛(wèi)星DNA 分子標(biāo)記的方法，利用

BM4621、BM143、OarHH55、OarJMP8、BM6438、BM6506、BM1824、OarDB6、ILSTS004 9 個微衛(wèi)星位點，對132 只中國美利奴羊中的7 組親子進(jìn)行親子鑒定。

1 材料與方法

1.1 試驗血樣制備及基因組DNA 的提?。?］

血液樣本取自新疆紫泥泉種羊場的132 只中國美利奴羊(新疆軍墾型)，其中包括7 個不同的親子關(guān)系清楚的個體及其父母本。祖代及后代羊都飼養(yǎng)于該場，飼養(yǎng)管理穩(wěn)定，無疾病史。綿羊頸靜脈采血約6 ml，參照劉云芳等［6］的方法提取綿羊基因組DNA。

1.2 微衛(wèi)星位點引物合成及PCR 擴(kuò)增

選取的9 個微衛(wèi)星引物均由上海生物工程公司合成，其堿基序列及退火溫度見表1。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系:10×Buffer 2.5 μl，25 mmol/L MgCl21.5 μl，2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μl，上下游引物各3.0 μl (5 pmol/μl)，TaqE(0.5 U/μl)4.0 μl，模板DNA (50 ng)2.0 μl，總體積25.0 μl。PCR 擴(kuò)增條件為:95℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s，在適宜的溫度退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35 個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

1.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測

25 μl PCR 產(chǎn)物中加 3 ～5 μl 溴酚藍(lán)指示劑，混勻后加10 μl 在聚丙烯酰胺凝膠(濃度為10%)中電泳，穩(wěn)壓150 ～180 V，電泳 6 ～8 h。電泳結(jié)束后進(jìn)行固定、染色、顯影過程，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

采用銀染的方法，染色及顯影的過程如下:將凝膠放入固定液中預(yù)處理10 min，然后將凝膠放入染色液中染色25 min，取出后用蒸餾水漂洗15 ～20 s，置于顯影液中，約 8 ～10 min 出現(xiàn)條帶后，取出凝膠用自來水快速漂洗2 次，放入固定液終止10 min，觀察結(jié)果并拍照［7］。

表1 9 個微衛(wèi)星標(biāo)記的引物序列及退火溫度Table 1 Primer sequences of nine microsatellite markers and reference annealing temperatures

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計方法

1.4.1 基因頻率及基因型頻率 基因頻率是指群體內(nèi)某一基因座上特定等位基因占該基因座等位基因總數(shù)的比率(Pi)，即為等位基因頻率，是群體遺傳特征的基本要素。Pi=［2(ii)+(ij1)+(ij2)+…+(ijn)］/2N，其中，Pi為某一位點上第i個等位基因的頻率，i為該位點上的第i個等位基因，j1、j2、…、jn為與i共顯性的第1 到第n個等位基因;N為該位點上的等位基因數(shù)?；蛐皖l率是指一個群體內(nèi)某特定基因型所占的比例，它是描述群體遺傳結(jié)構(gòu)的重要參數(shù)。由于微衛(wèi)星擴(kuò)增結(jié)果為共顯性等位基因，因此，表型頻率即為基因型頻率，基因型頻率=基因型個體數(shù)/測定群體總數(shù)。

1.4.2 Handy-Weinberg 平衡的χ2適合性試驗Handy-Weinberg 平衡狀態(tài)的檢驗采用χ2適合性檢驗進(jìn)行。首先根據(jù)基因頻率計算各種基因型頻率的理論值，然后計算χ2值。χ2=∑(E-O)2/E，E為理論值，O為實際觀察值。

1.4.3 父權(quán)概率計算［8-9］根據(jù)所檢測的表型，分別列出母本、子一代及假設(shè)父本的各種可能的基因型。根據(jù)母子組合，確定來自母本的基因(母本基因)和必定來自子一代父本的基因(父本基因)。計算嫌疑父本成為子一代父本的概率:X=f×c，式中f為母本提供母本基因的概率(當(dāng)只有一種母本基因時，該基因100%遺傳給子代，故此時母本基因概率為1)，c為嫌疑父本提供父本基因的概率。計算種群中隨機(jī)個體成為子一代父本的概率:Y=f×g，式中f為母本提供母本基因的概率，g為種群中該父本的基因頻率。計算父權(quán)指數(shù)(PI)，PI=X/Y。再計算父權(quán)的相對機(jī)會RCP(Relative Chance of Paternity)值和累積RCP，RCP=PI/(PI+1)，累積RCP=1-(1-RCP1)(1-RCP2)……(1-RCPn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 等位基因頻率分布

由表2 可知，9 個微衛(wèi)星位點共檢測到56 個等位基因，平均每個位點6.2 個。OarHH55 位點等位基因最多，共檢測到8 個;BM6506、BM6438、BM1824 3 個位點都只檢測到5 個等位基因。

表2 綿羊9 個微衛(wèi)星位點基因頻率分布Table 2 Allele frequencies of 9 STR loci in sheep

2.2 9 個STR 基因位點的基因分型

從表3 可以看出:在對7 組父母本與子代的親子鑒定中，第1 組的累積RCP值為0.999 8，第2 組的累積RCP值為0.999 9，第3 組的累積RCP值為0.999 9，第4 組的累積RCP值為 0.999 8，第5組的累積RCP值為0.999 9，第6 組的累積RCP值為0.999 9，第7 組的累積RCP值為0.999 9。這7組累積父權(quán)概率都已達(dá)到很高的鑒別水平，說明本試驗所用的9 個微衛(wèi)星位點都可用做鑒定綿羊親子關(guān)系的微衛(wèi)星標(biāo)記位點。

表3 9 個微衛(wèi)星位點PI 值及RCP 值Table 3 PI and RCP values of 9 STR loci

3 討論

親子鑒定又稱親權(quán)鑒定，SSR 分子標(biāo)記技術(shù)［10-11］是目前國內(nèi)外進(jìn)行親子鑒定的新技術(shù)之一。賈名威等［12］在奶牛和肉牛中分別擇選了6 個微衛(wèi)星座位，累積個體鑒別力和累積非父排除能力都很高。Ellegren 等［10］組合5 個微衛(wèi)星位點(每個位點至少有6 個等位基因)排除率達(dá)98%以上，使用10個微衛(wèi)星位點可使排除率達(dá)99.99%。賈斌等［13］利用10 個微衛(wèi)星座位對新疆8 個綿羊品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明8 個高度多態(tài)性的座位可用于遺傳多樣性分析。Araujo 等［14］用11 個微衛(wèi)星標(biāo)記對巴西山羊進(jìn)行親權(quán)鑒定研究，結(jié)果表明，當(dāng)已知一方親本時的累計父權(quán)排除率為 0.999 59。張志和等［15］在大熊貓的親子鑒定中，父權(quán)排除率達(dá)到了0.999 921。李潔等［16］擇選13 個微衛(wèi)星標(biāo)記對甘肅高山細(xì)毛羊進(jìn)行親子鑒定，累計父權(quán)排除概率為0.999 94，11 個高度多態(tài)的座位使累計父權(quán)排除率達(dá)到0.999 85。周磊等［17］利用微衛(wèi)星技術(shù)研究親子鑒定，證明了微衛(wèi)星座位的多態(tài)性決定了父權(quán)排除率的大小。錢林東等［18］使用微衛(wèi)星標(biāo)記分析發(fā)現(xiàn)，一般檢測的遺傳座位多少與鑒定概率成正比，相同的微衛(wèi)星位點在群體中的等位基因數(shù)與正確鑒定結(jié)果的概率也成正比。本研究采用微衛(wèi)星DNA 分子標(biāo)記技術(shù)分析計算了132 只中國美利奴羊在9 個微衛(wèi)星位點的等位基因頻率及其分布規(guī)律，9 個微衛(wèi)星位點均表現(xiàn)為高度或中度多態(tài)性;對其中7 組父系半同胞親子進(jìn)行了親子鑒定，獲得了0.999 8 ～0.999 9 的父權(quán)概率，說明這9 個微衛(wèi)星位點在親緣關(guān)系較近的群體中做親子鑒定是可行的，這為綿羊親子鑒定試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)。

用微衛(wèi)星DNA 或DNA 測序進(jìn)行親子鑒定技術(shù)精確度較高，發(fā)展較快，但由于成本問題在家畜中較難開展和推廣。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和測序成本的降低，基于分子生物學(xué)的親子鑒定技術(shù)必將在家畜中得到廣泛的應(yīng)用。所以篩選用于親子鑒定的可靠、合適的微衛(wèi)星位點代替血型、DNA 指紋等傳統(tǒng)方法進(jìn)行血緣鑒定和血緣控制在家畜中的應(yīng)用潛力很大。

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