李俊州， 王春梅， 文才藝， 臧 睿

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河南 鄭州450002;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210014)

番茄黃化曲葉病毒病是由中國(guó)番茄黃化曲葉病毒(TYLCCV)引起的一種番茄生產(chǎn)上的毀滅性病害，主要由煙粉虱或嫁接傳播［1-2］。該病于1939 ～1940 年在以色列番茄產(chǎn)區(qū)首次被發(fā)現(xiàn)［3］，隨后在中東、非洲、美洲、歐洲和亞洲等地區(qū)相繼發(fā)生［4-6］。20 世紀(jì)90 年代初，中國(guó)僅在廣西、廣東、臺(tái)灣和云南等地零星發(fā)生，自2005 年開(kāi)始，番茄黃化曲葉病毒病在廣西、廣東、浙江、江蘇、河南和上海等地大面積暴發(fā)，給當(dāng)?shù)胤焉a(chǎn)造成了嚴(yán)重的損失。2009 ～2010 年，番茄黃化曲葉病毒病在江蘇、山東和河南等省再次大面積暴發(fā)，發(fā)病地塊減產(chǎn)嚴(yán)重，個(gè)別嚴(yán)重的發(fā)病地塊絕產(chǎn)絕收，已成為對(duì)番茄產(chǎn)量影響最嚴(yán)重的病害之一［7］。目前防治番茄黃化曲葉病毒病的方法主要是選育抗病品種和利用化學(xué)藥劑防治煙粉虱，但是由于中國(guó)番茄黃化曲葉病毒為單鏈DNA 病毒，基因重組頻繁，不同地域的病毒分離物致病力存在很大差異，難以選育穩(wěn)定高抗品種，至今生產(chǎn)上還沒(méi)有穩(wěn)定有效的抗病品種［8］。針對(duì)傳毒介體煙粉虱的殺蟲(chóng)劑和多種抗病毒制劑雖然在一定程度上能控制該病害的發(fā)生、蔓延和危害，但是，化學(xué)防治容易導(dǎo)致作物藥害、農(nóng)藥殘留及昆蟲(chóng)抗藥性等安全生產(chǎn)問(wèn)題。近年來(lái)，除了利用現(xiàn)代生物技術(shù)如轉(zhuǎn)基因工程、RNA 沉默等途徑控制TYLCCV 病外［9］，人們開(kāi)始關(guān)注利用生物防治等安全有效的防治手段控制番茄黃化曲葉病毒病方面的研究工作。如Abdelbacki 等［10］用乳清蛋白質(zhì)防治TYLCV 取得良好的效果;王春梅［11］研究了丁香酚對(duì)番茄抗黃化曲葉病毒的誘導(dǎo)機(jī)理，結(jié)果表明丁香酚可以通過(guò)提高抗病相關(guān)酶活性，增強(qiáng)番茄植株對(duì)中國(guó)番茄黃化曲葉病毒的抗性。在番茄黃化曲葉病毒病害生防菌株的篩選方面，邢衛(wèi)鋒等［12］篩選出2 株對(duì)該病害大田防治效果穩(wěn)定，且可提高番茄產(chǎn)量和改善番茄品質(zhì)的生防細(xì)菌。

內(nèi)生枯草芽胞桿菌EBS05(CGMCC No.5239)是從樟樹(shù)周皮組織中分離的1 株生防細(xì)菌。前期研究結(jié)果表明，菌株EBS05 對(duì)小麥、煙草、黃瓜和辣椒等植物具有明顯的促生長(zhǎng)作用，同時(shí)，該菌所產(chǎn)生的脂肽類抗生素Surfactin A 是誘導(dǎo)煙草對(duì)煙草花葉病毒(TMV)產(chǎn)生系統(tǒng)抗性的有效激發(fā)子，其誘導(dǎo)抗性效果達(dá)67.38%，顯示出在植物病毒病害防治方面的應(yīng)用潛力［13］。為了進(jìn)一步挖掘內(nèi)生生防細(xì)菌EBS05 的生防潛力，本試驗(yàn)初步研究了EBS05 對(duì)番茄抗TYLCCV 的誘導(dǎo)抗性作用，為有效控制番茄黃化曲葉病毒病以及新型抗病毒微生物農(nóng)藥的研制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

生防細(xì)菌EBS05 由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病害生物防治研究室分離、保存;供試植物材料番茄(江蔬14 號(hào))和TYLCCV 侵染性克隆，分別由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品質(zhì)量安全與檢測(cè)研究所和植物保護(hù)研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)處理 選取長(zhǎng)勢(shì)一致的5 葉期番茄幼苗120 株，分別做如下處理:①50 ml 清水灌根未接種處理(CK);②50 ml 清水灌根處理1 d 后接種TYLCCV(T1);③50 ml EBS05 菌懸液(菌液濃度為108CFU/ml)灌根處理(T2);④50 ml EBS05 菌懸液(菌液濃度為108CFU/ml)灌根處理1 d 后接種TYLCCV(T3)。

1.2.2 試驗(yàn)方法

1.2.2.1 菌株EBS05 對(duì)番茄抗TYLCCV 的誘導(dǎo)效果 EBS05 菌懸液灌根處理后自然生長(zhǎng)21 d 后，觀察番茄植株的生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)平均株高、根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量等生理指標(biāo);接種TYLCCV 后第20 d 調(diào)查發(fā)病情況，參照Friedmann 等［14］報(bào)道的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算病情指數(shù)和誘抗效果。

病情指數(shù)(DI)= ∑(發(fā)病株數(shù)× 發(fā)病級(jí)數(shù))/(調(diào)查總株數(shù)×最高病級(jí)數(shù))×100

誘抗效果=(對(duì)照平均病情指數(shù)一處理平均病情指數(shù))/對(duì)照平均病情指數(shù)×100%

1.2.2.2 菌株EBS05 對(duì)番茄葉片防御酶活性的影響 分別于接種TYLCCV 后1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d 和15 d 取番茄同一部位的葉片用于相關(guān)生理指標(biāo)的測(cè)定，3 次重復(fù)。粗酶液提取采用易龍等［15］報(bào)道的方法;超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑還原法［16］測(cè)定;過(guò)氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚比色法［17］測(cè)定;多酚氧化酶(PPO)活性參照雷東峰等［18］報(bào)道的方法測(cè)定;苯丙氨酸氧化酶(PAL)活性參照劉太國(guó)等［19］報(bào)道的方法測(cè)定。

1.2.2.3SOD、POD和PPO同工酶電泳分析 參照蘇杭等［20］報(bào)道的方法略有改動(dòng)。同工酶電泳采用10%分離膠、5%濃縮膠，上樣量為25 μl，于4 ℃下電泳，電壓80 V 預(yù)電泳1 h，濃縮膠80 V 電泳30 min，分離膠110 V 電泳5 h。SOD和PPO同工酶染色參照文才藝［21］報(bào)道的方法，POD同工酶染色參照劉素純等［22］報(bào)道的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株EBS05 對(duì)番茄抗黃化曲葉病毒的誘導(dǎo)效果

研究結(jié)果顯示，EBS05 菌懸液誘導(dǎo)處理后，對(duì)番茄植株的促生作用明顯(圖1)，其平均株高、根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量等生理指標(biāo)明顯大于清水對(duì)照。接種TYLCCV 處理后，經(jīng)EBS05 誘導(dǎo)處理的番茄植株發(fā)病時(shí)間延遲，對(duì)照植株接種TYLCCV 后第9 d 開(kāi)始發(fā)病，而菌株EBS05 誘導(dǎo)處理的植株在接種TYLCCV 后第15 d 開(kāi)始出現(xiàn)輕微癥狀，且植株長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于對(duì)照;接種TYLCCV 后第15 d，對(duì)照植株葉片出現(xiàn)變小、卷曲和黃化等典型癥狀，而菌株EBS05誘導(dǎo)處理的植株僅頂端個(gè)別葉片出現(xiàn)卷曲和黃化現(xiàn)象，其他部位葉片癥狀不明顯;接種TYLCCV 后20 d，菌株EBS05 誘導(dǎo)處理的植株病情指數(shù)顯著低于對(duì)照，誘導(dǎo)抗病性效果為53.60%(表1)。

圖1 菌株EBS05 對(duì)番茄植株的促生效果Fig.1 Growth promotion of tomato plants by strain EBS05

表1 菌株EBS05 對(duì)番茄植物的誘抗效果Table 1 Induced resistance in tomato by strain EBS05

2.2 菌株EBS05 誘導(dǎo)處理后番茄體內(nèi)防御酶活性的變化

2.2.1 超氧化物歧化酶(SOD)活性 由圖2 可見(jiàn)，僅接種TYLCCV 或僅用菌株EBS05 誘導(dǎo)處理以及菌株EBS05 誘導(dǎo)處理再接種TYLCCV，葉片中SOD活性均較清水對(duì)照明顯提高，其中，菌株EBS05 誘導(dǎo)處理再接種TYLCCV，SOD活性增加幅度最大，且于接種后第7 d 達(dá)到最高峰值，顯著高于清水對(duì)照和其他處理。僅用菌株EBS05 誘導(dǎo)處理時(shí)SOD活性變化趨勢(shì)與對(duì)照基本一致，且相對(duì)穩(wěn)定，接種TYLCCV 后，SOD活性發(fā)生明顯的變化。由此可見(jiàn)，菌株EBS05 誘導(dǎo)處理再接種TYLCCV 后植株體內(nèi)SOD活性的變化是菌株EBS05 誘導(dǎo)植物與TYLCCV 互作的結(jié)果。

圖2 不同處理下番茄體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性的變化Fig.2 Changes of SOD activity in tomato plants with different treatments

2.2.2 過(guò)氧化物酶(POD) 活性 如圖3 所示，僅接種TYLCCV 后1 ～3 d，POD活性變化不大，至第5 d 時(shí)，迅速增加，之后，逐漸降低，至第9 d 后，始終低于清水對(duì)照;僅用菌株EBS05 誘導(dǎo)處理后1 ～5 d，POD活性降低，處理后第7 d 開(kāi)始，活性迅速升高，且活性值始終顯著高于清水對(duì)照;菌株EBS05 誘導(dǎo)處理再接種TYLCCV 后3 ～15 d，POD活性均較清水對(duì)照顯著增加，其中，接種后第11 d 達(dá)到高峰值。

2.2.3 多酚氧化酶(PPO) 活性 如圖4 所示，僅接種TYLCCV 后第1 d，PPO活性略有下降，接種后3 ～7 d，PPO活性表現(xiàn)為先升高后下降，處理后至第9 ～15 d，PPO活性始終低于清水對(duì)照;僅用菌株EBS05 誘導(dǎo)處理后，除了處理后第1 d，PPO活性顯著降低于清水對(duì)照外，處理后第3 ～15 d，PPO活性均顯著高于清水對(duì)照，其中，處理后第7 d 時(shí)，達(dá)到高峰值;菌株EBS05 誘導(dǎo)處理再接種TYLCCV 后，PPO活性均顯著高于清水對(duì)照，其中，處理后第3 d，達(dá)到最高峰值。

圖3 不同處理下番茄體內(nèi)過(guò)氧化物酶(POD)活性的變化Fig.3 Changes of POD activity in tomato plants with different treatments

圖4 不同處理下番茄體內(nèi)多酚氧化酶(PPO)活性的變化Fig.4 Changes of PPO activity in tomato plants with different treatments

2.2.4 苯丙氨酸解氨酶(PAL) 活性 如圖5 所示，僅接種TYLCCV 處理或僅用菌株EBS05 誘導(dǎo)處理以及菌株EBS05 誘導(dǎo)處理再接種TYLCCV，番茄植株體內(nèi)PAL活性均高于清水對(duì)照。其中，菌株EBS05 誘導(dǎo)處理后，PAL活性呈逐漸升高趨勢(shì)，至處理后第9 ～15 d，PAL活性穩(wěn)定保持在較高水平。菌株EBS05 誘導(dǎo)處理再接種TYLCCV 后1 ～7 d 后，PAL活性逐漸增加，且顯著高于清水對(duì)照和其他處理;菌株EBS05誘導(dǎo)處理再接種TYLCCV 后9 ～15 d，PAL活性逐漸降低，但均高于清水對(duì)照和僅接種TYLCCV 處理。

圖5 不同處理下番茄體內(nèi)苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的變化Fig.5 Changes of PAL activity in tomato plants with different treatments

2.3 菌株EBS05 誘導(dǎo)處理后番茄植株體內(nèi)同工酶的變化

2.3.1 超氧化物歧化酶(SOD) 同工酶 如圖6 所示，清水對(duì)照番茄植株體內(nèi)SOD同工酶均顯示2 條譜帶，而其他處理，同工酶譜帶均較清水對(duì)照強(qiáng)(亮)，且均出現(xiàn)1 條新的同工酶譜帶。該結(jié)果與SOD活性測(cè)定結(jié)果一致，處理后SOD活性升高可能與新的同工酶產(chǎn)生有關(guān)。3 個(gè)處理組中，菌株EBS05誘導(dǎo)處理再接種TYLCCV 后的同工酶帶強(qiáng)度最強(qiáng)，僅用菌株EBS05 誘導(dǎo)處理和僅接種TYLCCV 處理后同工酶帶強(qiáng)度基本一致，進(jìn)一步印證了菌株EBS05 對(duì)植株體內(nèi)SOD活性的影響是EBS05 誘導(dǎo)植物與TYLCCV 互作的結(jié)果。

2.3.2 過(guò)氧化物酶(POD) 同工酶 如圖7 所示，各處理同工酶帶的強(qiáng)度對(duì)比情況與POD活性測(cè)定結(jié)果一致。清水對(duì)照和僅接種TYLCCV 處理，植株體內(nèi)POD同工酶均為2 條譜帶，菌株EBS05 誘導(dǎo)處理和菌株EBS05 誘導(dǎo)再接種TYLCCV 后，分別于處理后第3 d 和11 d 產(chǎn)生1 條新的POD同工酶帶，表明菌株EBS05 可誘導(dǎo)番茄產(chǎn)生新的POD同工酶帶。

2.3.3 多酚氧化酶(PPO) 同工酶 如圖8 所示，僅接種TYLCCV 后1 ～5 d，PPO同工酶譜帶與清水對(duì)照一致，均為2 條，但是條帶的強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，處理后7 ～15 d，小分子量的同工酶帶明顯減弱，甚至消失;僅用菌株EBS05 誘導(dǎo)處理后1 ～3 d，PPO同工酶帶明顯減弱，處理后第5 d 起，同工酶帶逐漸增強(qiáng)，第7 ～13 d，產(chǎn)生新的同工酶帶;菌株EBS05 誘導(dǎo)處理再接種TYLCCV 后，無(wú)新的PPO同工酶帶產(chǎn)生，但是同工酶帶明顯增強(qiáng)。表明，番茄接種TYLCCV 后7 ～11 d，植株開(kāi)始發(fā)病，而用菌株EBS05 誘導(dǎo)處理后，能有效控制病害的發(fā)生，由此推測(cè)，TYLCCV 侵染可抑制PPO同工酶的形成，而新PPO同工酶帶的產(chǎn)生可能是菌株EBS05 誘導(dǎo)番茄系統(tǒng)抗病性的結(jié)果。

圖6 不同處理下番茄體內(nèi)超氧化物歧化酶同工酶的變化Fig.6 Changes of SOD isozymes in tomato plants with different treatments

圖7 不同處理后番茄體內(nèi)過(guò)氧化物酶同工酶的變化Fig.7 Changes of POD isozymes in tomato plants with different treatments

圖8 不同處理下番茄體內(nèi)多酚氧化酶同工酶的變化Fig.8 Changes of PPO isozymes in tomato plants with different treatments

3 討論

研究寄主植物與病原物互作或寄主植物抗病性生理生化機(jī)制是植物病害防治的重要基礎(chǔ)工作之一。大量研究結(jié)果表明，超氧化物歧化酶(SOD)活性、過(guò)氧化物酶(POD)活性、多酚氧化酶(PPO)活性和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性等防御酶活性與植物抗病性密切相關(guān)，不同植物病害體系其相關(guān)的程度不同。SOD是生物體中最重要的活性氧自由基清除酶，可以減輕植物體內(nèi)自由基對(duì)細(xì)胞的損傷。POD是植物體內(nèi)重要的氧化酶，可以催化脂肪酸、芳香胺和酚類物質(zhì)的氧化，是木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶之一，還參與乙烯的生物合成和氧自由基的消除反應(yīng)。PPO能將酚類物質(zhì)氧化成對(duì)病原菌有毒的醌類物質(zhì)，進(jìn)而抑制病原菌并阻止其擴(kuò)展。PAL是苯丙烷類代謝途徑中的關(guān)鍵酶和限速酶，能催化苯丙胺酸脫氨基后產(chǎn)生肉桂酸，最終轉(zhuǎn)化成木質(zhì)素。本研究結(jié)果結(jié)果表明，菌株EBS05 誘導(dǎo)處理后，番茄體內(nèi)SOD、PPO和PAL活性均有不同程度的提高，POD活性在誘導(dǎo)處理后1 ～5 d 略有下降，但是從誘導(dǎo)處理后第7 d 起，活性迅速升高，其始終顯著高于清水對(duì)照。誘導(dǎo)處理再接種TYLCCV 后，SOD、POD、PPO和PAL活性均明顯高于清水對(duì)照。結(jié)合番茄黃化曲葉病毒病病程分析，番茄植株在接種TYLCCV 后第9 d 開(kāi)始發(fā)病，而第9 d 后，誘導(dǎo)處理的番茄植物體內(nèi)SOD、POD、PPO和PAL活性均顯著高于清水對(duì)照，由此可見(jiàn)，菌株EBS05 誘導(dǎo)處理后番茄植物黃化曲葉病毒病害表現(xiàn)延遲和發(fā)病程度減輕與番茄體內(nèi)防御酶活性的提高有一定的相關(guān)性。該研究結(jié)果與苯并噻二唑(BTH)和核黃素誘導(dǎo)番茄抗番茄黃化曲葉病毒的報(bào)道一致［23-24］。病原物侵染導(dǎo)致寄主植物體內(nèi)一系列與酚類代謝相關(guān)的酶活性變化是病程中普遍發(fā)生的現(xiàn)象，常見(jiàn)的酶包括POD、PPO和PAL等，這些酶除參與酚類物質(zhì)代謝外，還參與木質(zhì)素、植保素等次生抗菌物質(zhì)的形成和積累，因此是人們研究植物抗病生理生化機(jī)制的重要內(nèi)容［25］。本研究結(jié)果表明，接種TYLCCV 后7 ～15 d(發(fā)病期)，POD和PPO活性顯著低于對(duì)照，相應(yīng)的同工酶積累量也減弱，尤其是PPO同工酶，在接種7 d 后小分子量的同工酶譜帶顯著減弱。而用生防細(xì)菌EBS05 誘導(dǎo)處理后7 ～15 d，POD和PPO活性均顯著提高，且產(chǎn)生新的同工酶譜帶。從PAL活性變化結(jié)果來(lái)看，用生防細(xì)菌EBS05 誘導(dǎo)處理后第5 d起，其活性逐漸增加，并于第9 d 后(對(duì)照開(kāi)始發(fā)病)，始終維持在較高的活性水平。內(nèi)生細(xì)菌EBS05 誘導(dǎo)處理再接種TYLCCV 后，PPO活性變化更為敏感，其高峰值出現(xiàn)在接種后第3 d，早于PAL、POD和SOD活性高峰值的出現(xiàn)。由此可以推測(cè)，內(nèi)生細(xì)菌EBS05誘導(dǎo)番茄對(duì)TYLCCV 的抗病性可能與番茄體內(nèi)酚類代謝途徑密切相關(guān)。

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