趙偉剛，鹿振武，逯盛芳，何乃普

(蘭州交通大學(xué) 功能高分子研究所，甘肅 蘭州 730700)

蛋白質(zhì)-高分子聚合物的耦合物被廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥、生物技術(shù)和納米技術(shù)中。聚合物以共價(jià)鍵結(jié)合到蛋白質(zhì)上，可提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，溶解性和生物相容性。此外，給合成聚合物賦予新的屬性，如自組裝和相位行為［1-3］。

基于修飾蛋白質(zhì)賴氨酸側(cè)鏈的蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體，例如蛋白質(zhì)-聚乙二醇(PEG)結(jié)合體，被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)療，生物親和力分離，微蛋白分析和捕獲，分子傳感器，以及作為交換器來(lái)控制蛋白質(zhì)活性等［4-8］。該聚合物在通常情況下是可溶于水的［4］，當(dāng)受到外部刺激，例如光照、溫度和pH 值，能夠發(fā)生構(gòu)象變化從而實(shí)現(xiàn)相分離。附著的聚乙二醇(PEG)蛋白質(zhì)或肽的結(jié)合物在醫(yī)療上的應(yīng)用，被稱為聚乙二醇化，是一個(gè)應(yīng)用非常成功的例子，其產(chǎn)生了幾個(gè)好處包括增加的生物利用度和血漿半衰期，降低免疫原性，減少蛋白水解，增強(qiáng)溶解性和穩(wěn)定性［9］。

“活性”/可控自由基聚合(LRP)技術(shù)是分子設(shè)計(jì)的重要途徑［10-15］，在制備窄的分子量分布(MWD)聚合物，分子量(MW)符合理論計(jì)算值的聚合物，以及各種嵌段共聚物和復(fù)雜大分子結(jié)構(gòu)等方面有廣泛應(yīng)用?！盎钚浴?可控自由基聚合反應(yīng)制備聚合物-蛋白質(zhì)生物結(jié)合體的研究領(lǐng)域主要集中在利用引發(fā)轉(zhuǎn)移終止劑法(Iniferter)、氮氧自由基聚合(NMP)、原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)和可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移活性自由基聚合(RAFT)4 種“活性”/可控自由基聚合體系來(lái)合成聚合物-蛋白質(zhì)生物結(jié)合體［9］，以及對(duì)生物結(jié)合體共價(jià)鍵連接方式及所需的官能性引發(fā)劑的研究。

1 “活性”/可控自由基聚合物接枝蛋白質(zhì)

“活性”/可控自由基聚合結(jié)合了活性聚合與自由基聚合的各種優(yōu)勢(shì)，美國(guó)科學(xué)家Szwarc［16-18］在1956 年提出了活性聚合的概念，自從有了“活性”/可控自由基聚合后，高分子領(lǐng)域得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，因?yàn)椤盎钚浴?可控自由基聚合與傳統(tǒng)自由基聚合相比，具有無(wú)終止、無(wú)轉(zhuǎn)移、引發(fā)速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于鏈增長(zhǎng)速率等特點(diǎn)，能更好地實(shí)現(xiàn)對(duì)分子結(jié)構(gòu)的控制，是實(shí)現(xiàn)分子設(shè)計(jì)、合成具有特定結(jié)構(gòu)和性能聚合物的重要手段。但離子型活性聚合反應(yīng)條件比較苛刻、適用單體較少，且只能在非水介質(zhì)中進(jìn)行，導(dǎo)致工業(yè)化成本居高不下，難以廣泛用于工業(yè)化。鑒于活性聚合和自由基聚合各自的優(yōu)缺點(diǎn)，高分子合成化學(xué)家們聯(lián)想到將二者結(jié)合，即“活性”/可控自由基聚合［19-20］。目前，將“活性”/可控自由基聚合應(yīng)用到蛋白質(zhì)結(jié)合物的研究很多，已成為醫(yī)學(xué)界與高分子界交叉的熱門研究。

1.1 Iniferter 在蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體制備中的應(yīng)用

引發(fā)轉(zhuǎn)移終止劑法(Iniferter)是指那些同時(shí)集引發(fā)劑、轉(zhuǎn)移劑和終止劑作用于一身的物質(zhì)［21］。1982 年Otus 發(fā)現(xiàn)Iniferter 以來(lái)，其文獻(xiàn)報(bào)道較少，其分類很多，按其引發(fā)類型主要分為光引發(fā)和熱引發(fā)兩類，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［22］其光引發(fā)Iniferter 比熱引發(fā)Iniferter 更有效。引發(fā)轉(zhuǎn)移終止劑引發(fā)的活性自由基聚合機(jī)理是，當(dāng)體系中穩(wěn)定存在的自由基的濃度遠(yuǎn)大于鏈自由基的濃度時(shí)，促使平衡正向移動(dòng)，形成的休眠種大幅度降低鏈自由基的濃度，以減少鏈終止反應(yīng)。Iniferter“活性”自由基聚合的特點(diǎn)是聚合產(chǎn)物的分子量隨聚合時(shí)間的增加而增大，分子量隨單體轉(zhuǎn)化率的增大而增大;當(dāng)轉(zhuǎn)化率不大于40%時(shí)，聚合反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率和分子量隨反應(yīng)時(shí)間成較好的線性關(guān)系，但分子量分布可控性不好，分子量分布(PDI)一般在2.0 左右［23］。目前已經(jīng)合成了許多結(jié)構(gòu)新穎的引發(fā)轉(zhuǎn)移終止劑，并將其用于制備端基功能化聚合物、遙爪聚合［24］、大分子單體［25-26］、嵌段和接枝共聚物［27］等。近十年來(lái)，這類研究在基因轉(zhuǎn)導(dǎo)劑、藥物載體等領(lǐng)域得到了迅速發(fā)展［28］。

Wootthikanokkhan J［28］用N，N-二乙基二硫代氨基甲酸芐酯(BDC)為引發(fā)劑，先聚合異戊二烯單體;以此為巨型引發(fā)劑與MMA 光聚合制備了線型PI/PMMA 兩嵌段共聚物［29］;以自合成的1，3，5-(N，N-二甲基二硫代氨基甲酸)-2，4，6-均苯三甲基芐酯為多臂引發(fā)劑，合成了星型二嵌段共聚物PI/PMMA，PI/PS 和星型三嵌段共聚物PI/PMM/PS。合成的星型多嵌段共聚物通過(guò)引入生物活性基團(tuán)或環(huán)境友好單體可以用作潛在藥物載體。Miyamoto等［30-31］首先也用N，N-二乙基二硫代氨基甲酸芐酯(BDC)為光引發(fā)劑，聚合單體2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰膽堿(MPC)，在N，N-二環(huán)己基碳酰亞胺(DCC)存在的條件下，合成了末端帶有羧基的MPC的共聚物PMPC-COOH(如圖1 所示)而將木瓜蛋白酶固定在PMPC-COOH 上。對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):未結(jié)合的木瓜酶在一周內(nèi)失去活性，用PEO 鍵合的木瓜蛋白酶的活性一周后降低50%，而用PMPC-COOH 修飾的木瓜蛋白酶的活性4 周后無(wú)降低。所以，可以通過(guò)控制PMPC-COOH 的摩爾質(zhì)量和對(duì)酶的修飾程度來(lái)穩(wěn)定酶的活性，得到具有良好生物相容性的蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體。Ishihara 等［31-32］用光引發(fā)聚合的PMPC 接枝得到水溶性纖維素MGC，用MGC 修飾的中空纖維微透析探頭(mi-crodialysis probe)長(zhǎng)期植入體內(nèi)不會(huì)引發(fā)明顯的炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)出良好的生物相容性和穩(wěn)定性。Bai 等［31，33］將具有高靈敏度的電化學(xué)發(fā)光物質(zhì)固定在光引發(fā)聚合的PMPC 材料上，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明這種發(fā)光裝置具有良好的抗生物污染性能，可以用于研制各種與生物監(jiān)測(cè)有關(guān)的傳感器。

圖1 PMPC 的Iniferter 活性聚合Fig.1 PMPC’s Iniferter living polymerization

1.2 NMP 在蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體制備中的應(yīng)用

NMP 活性自由基聚合屬于非催化性體系，是利用氮氧穩(wěn)定自由基來(lái)控制自由基聚合［34］。其機(jī)理是利用氮氧自由基與鏈增長(zhǎng)自由基之間的結(jié)合和可逆分解來(lái)實(shí)現(xiàn)單體的活性可控聚合，NMP 典型的引發(fā)劑是2，2，6，6-四甲基哌啶氮氧自由基(TEMPO)，TEMPO 作為穩(wěn)定自由基，只與增長(zhǎng)自由基發(fā)生偶合形成共價(jià)鍵，而這種共價(jià)鍵在高溫條件下又可以分解產(chǎn)生增長(zhǎng)自由基和穩(wěn)定自由基，通過(guò)這種可逆的鏈終止反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了單體(M)的活性自由基聚合。

Rutger 等［35-37］利用N-羧酸酐(NCA)開環(huán)后形成一個(gè)雙頭引發(fā)劑，運(yùn)用NMP 法聚合成多肽-聚合物結(jié)合物，其反應(yīng)如圖2 所示。研究表明，在利用這種合成方法合成由多肽組成的嵌段共聚物的過(guò)程中，每個(gè)鏈段中多肽的化學(xué)計(jì)量和區(qū)域選擇性是可控的。

圖2 通過(guò)NCA 聚合生物聚合物的NMP 聚合形成多肽嵌段共聚物Fig.2 A block copolymer was obtained by polymerization of NCA polypeptide biopolymers polymerized to form NMP

Chenal 等［38］利用帶有N-羥基琥珀酰亞胺基團(tuán)的鏈段(SG1)的烷氧基胺為引發(fā)劑，實(shí)現(xiàn)了聚甲基丙烯酸乙二醇甲基醚酯(MePEGMA)的NMP 聚合，得到了一種基于氮氧SG1α-功能化的帶有聚乙二醇側(cè)鏈的梳狀聚甲基丙烯酸酯的聚乙二醇化聚合物。另外，以溶菌酶作為模型蛋白與其結(jié)合，進(jìn)一步證明了上述合成路徑的高效性。NMP 在活性聚合反應(yīng)中雖然分子量控制很好，可是其反應(yīng)溫度較高，合成過(guò)程較復(fù)雜，產(chǎn)率低，并且氮氧自由基的價(jià)格昂貴等這些因素限制了NMP 活性自由基聚合的廣泛研究。

1.3 ATRP 在蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體制備中的應(yīng)用

ATRP 法是1995 年由王錦山和Matyjaszewski［39-41］發(fā)現(xiàn)的。ATRP 聚合反應(yīng)以過(guò)渡金屬作為催化劑，使鹵原子實(shí)現(xiàn)可逆轉(zhuǎn)移，包括鹵原子從烷基鹵化物到過(guò)渡金屬絡(luò)合物(鹽)，再?gòu)倪^(guò)渡金屬絡(luò)合物(鹽)轉(zhuǎn)移至自由基的反復(fù)循環(huán)的原子轉(zhuǎn)移過(guò)程，伴隨著自由基活性(增長(zhǎng)鏈自由基)種和大分子有機(jī)鹵化物休眠種之間的可逆轉(zhuǎn)換平衡反應(yīng)，從而控制自由基活性種保持較低的濃度，減少了增長(zhǎng)鏈自由基之間的不可逆雙分子終止副反應(yīng)，使聚合反應(yīng)得到有效的控制。但其缺點(diǎn)就是后處理比較繁瑣，不易從產(chǎn)物中提取出Cu 離子。

ATRP 自發(fā)現(xiàn)以來(lái)，由于其反應(yīng)條件溫和，在室溫，水溶劑中可反應(yīng)，所以這方面的聚合物和蛋白質(zhì)結(jié)合體的研究大量而詳盡。ATRP 聚合制備生物蛋白質(zhì)或肽結(jié)合物時(shí)，需要聚合物末端(或中間)鏈上有一個(gè)能與蛋白質(zhì)上的胺基(─NH2)或巰基(─SH)特異性結(jié)合的功能性官能團(tuán)。而這些功能基團(tuán)是通過(guò)使用一些含這些功能基團(tuán)的引發(fā)劑/轉(zhuǎn)移劑來(lái)接枝到聚合物末端(或中間)的。在ATRP 中具有功能性基團(tuán)的引發(fā)劑主要有以下圖3 所示的這些。

圖3 ATRP 中具有功能性的基團(tuán)的引發(fā)劑［37］Fig.3 The functional initiator groups of ATRP［37］

1.3.1 與蛋白質(zhì)胺基相接形成聚合物-蛋白質(zhì)結(jié)合體 Haddleton 等研究組［42］利用N-羥基琥珀酰胺引發(fā)劑(A1，A2，圖3)引發(fā)單體聚乙烯基乙二醇甲基醚(PEGMA)的ATRP 聚合，而后將聚合物PEGMA以共價(jià)鍵接枝到蛋白質(zhì)上，如圖4 所示，并通過(guò)SDS-PAGE 電泳分析得知，每個(gè)蛋白質(zhì)上大約共軛了6 ～7 個(gè)高分子鏈。

圖4 ATRP 聚合物的N-羥基琥珀酰胺與蛋白質(zhì)的胺基偶聯(lián)Fig.4 The polymer of ATRP amine of N-hydroxysuccinimide and protein coupling

Haddleton 等研究組［43-44］又利用一個(gè)縮酮保護(hù)醛基的引發(fā)劑(A3，圖3)，通過(guò)ATRP 的方法實(shí)現(xiàn)了PEGMA 的聚合，然后又在酸性條件下(pH=5 或6)將聚合物端基的縮酮水解掉，從而得到端基醛，而此端基醛又能和蛋白質(zhì)的胺基發(fā)生偶聯(lián)，從而實(shí)現(xiàn)了聚合物-蛋白質(zhì)的結(jié)合，如圖5 所示。

圖5 ATRP 聚合物的醛基與蛋白質(zhì)的胺基偶聯(lián)Fig.5 The polymer of ATRP of aldehyde and protein coupling

Hui Jiang 等［45］先通過(guò)ATRP 制得含有羧基的聚丙烯酸聚合物刷，而─COOH 在中性的pH 值和室溫條件下可以很容易地與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)反應(yīng)形成琥珀酰亞胺酯，琥珀酰亞胺酯和蛋白質(zhì)的胺基耦合形成蛋白質(zhì)-聚合物刷。

1.3.2 與蛋白質(zhì)巰基相接形成聚合物-蛋白質(zhì)結(jié)合體在與蛋白質(zhì)巰基相接的這種蛋白質(zhì)-高分子結(jié)合體在制備過(guò)程中，通常會(huì)用到馬來(lái)酰亞胺作為ATRP 引發(fā)劑，但是不能直接用帶有馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)的ATRP 引發(fā)劑引發(fā)聚合單體，因?yàn)橹苯邮褂脮?huì)同時(shí)引發(fā)馬來(lái)酰亞胺中可聚合部分發(fā)生聚合作用使其失去接枝蛋白質(zhì)巰基的活性。所以通常在這種反應(yīng)中有兩種設(shè)計(jì)方案:①高聚物接枝蛋白質(zhì)(“grafting to”)法［46-48］:用叔丁氧羰保護(hù)的帶有氨基的引發(fā)劑(A8，圖3)先與單體發(fā)生ATRP 聚合，其聚合物中叔丁氧羰保護(hù)的氨基再與3-馬來(lái)酰亞胺丙酰氯在N，N-二異丙基乙基胺的存在下通過(guò)酰胺化反應(yīng)引入馬來(lái)酰亞胺部分，或用呋喃保護(hù)的帶有馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)的引發(fā)劑(A9，圖3)先與單體發(fā)生ATRP 聚合，然后去除呋喃的保護(hù)獲得馬來(lái)酰亞胺部分，再與蛋白質(zhì)巰基耦合相接。②蛋白質(zhì)引發(fā)劑引發(fā)ATRP聚合(“grafting from”)法［49-50］:先利用蛋白質(zhì)巰基與馬來(lái)酰亞胺引發(fā)劑反應(yīng)，生成蛋白質(zhì)引發(fā)劑，再進(jìn)行ATRP 反應(yīng)，其反應(yīng)機(jī)理見(jiàn)圖6。

圖6 “grafting to”和“grafting from”的反應(yīng)機(jī)理Fig.6 The reaction mechanisms of“grafting to”and“grafting from”

Kelly Velonia 等［46］利用呋喃保護(hù)的馬來(lái)酰亞胺引發(fā)劑(A9，圖3)通過(guò)ATRP 聚合形成端基帶有呋喃保護(hù)的馬來(lái)酰亞胺的聚合物，反應(yīng)掉呋喃的保護(hù)，得到端基帶有馬來(lái)酰亞胺的聚合物，再與蛋白質(zhì)巰基通過(guò)共價(jià)鍵耦合，形成蛋白質(zhì)-高分子的結(jié)合物，接著通過(guò)“點(diǎn)擊”化學(xué)(“click”)在蛋白質(zhì)-聚合物的結(jié)合物上形成1，2，3-三唑。反應(yīng)見(jiàn)圖7。

圖7 “grafting to”的ATRP 聚合物偶聯(lián)蛋白質(zhì)巰基Fig.7 The polymer by ATRP and the thiol group of protein was conjugated by“grafting to”

Maynard 等［50］利用馬來(lái)酰亞胺先通過(guò)與蛋白質(zhì)巰基偶聯(lián)接枝到蛋白質(zhì)上形成蛋白質(zhì)引發(fā)劑，隨后利用蛋白質(zhì)引發(fā)劑引發(fā)單體N-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)進(jìn)行ATRP 聚合，從而生成蛋白質(zhì)-高分子的結(jié)合體，見(jiàn)圖8。以蛋白質(zhì)作為引發(fā)劑合成聚合物-高分子生物結(jié)合體的最大的優(yōu)點(diǎn)是不需要多步反應(yīng)就能實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)與聚合物結(jié)合。

1.4 RAFT 在蛋白質(zhì)雜化體制備中的應(yīng)用

1998 年Rizzardo 等［51-53］將雙硫酯類衍生物加入到傳統(tǒng)的自由基體系中，通過(guò)鏈段的加成和斷裂動(dòng)態(tài)平衡實(shí)現(xiàn)活性可控的［54-55］。

近年來(lái)，RAFT 的研究比較成熟，發(fā)展迅速，通常采用單官能度、雙官能度和多官能度的雙硫代酯類化合物作鏈轉(zhuǎn)移劑，從而成功地制備了嵌段［56］，接枝［57］，星型［58］高聚物。由于RAFT 聚合反應(yīng)條件溫和，后處理簡(jiǎn)單，產(chǎn)物的分子量分布較窄，并可合成復(fù)雜結(jié)構(gòu)的聚合物。近年來(lái)特別是利用RAFT活性聚合制備蛋白質(zhì)雜化體結(jié)合物成為科學(xué)研究的一個(gè)廣闊領(lǐng)域。但其所用鏈轉(zhuǎn)移劑雙硫酯的制備過(guò)程相對(duì)復(fù)雜的缺點(diǎn)使這一反應(yīng)略慢于ATRP 活性聚合的研究。在RAFT 活性聚合中引發(fā)聚合反應(yīng)又與蛋白質(zhì)耦合接枝的官能化的引發(fā)劑見(jiàn)圖9，這些引發(fā)劑都是與蛋白質(zhì)的巰基以共價(jià)鍵耦合相接。

圖8 “grafting from”的ATRP 聚合物偶聯(lián)蛋白質(zhì)巰基Fig.8 The conjugate polymer and the thiol group of protein by“grafting from”ATRP

圖9 RAFT 中具有功能性的基團(tuán)的引發(fā)劑［37］Fig.9 The functional initiator groups of RAFT

圖10 利用“grafting to”法的RAFT 聚合物接枝蛋白質(zhì)Fig.10 Grafted the polymer to protein by RAFT“grafting to”

1.4.1 “grafting to”的RAFT 聚合物-蛋白質(zhì)結(jié)合體

Davis 等［59-60］研究組以吡啶二硫化RAFT 的引發(fā)劑(R11，圖9)引發(fā)單體N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)進(jìn)行RAFT 活性聚合，形成聚合物P(HPMA)，但在此聚合物中它不同于ATRP 聚合所生成的聚合物的是它的接枝蛋白質(zhì)的官能化的吡啶二硫基團(tuán)在此聚合物的中間，見(jiàn)圖10。

1.4.2 “grafting from”的RAFT 聚合物-蛋白質(zhì)結(jié)合體 Sumerlin 等［61］運(yùn)用帶有馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)的RAFT 引發(fā)劑先與牛血清白蛋白(BSA)的巰基以共價(jià)鍵相耦合形成蛋白質(zhì)的RAFT 引發(fā)劑(R13，圖9)，接著引發(fā)RAFT 活性聚合單體N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)聚合生成蛋白質(zhì)高分子結(jié)合體，見(jiàn)圖11。

圖11 利用“grafting from”法的RAFT 聚合物接枝蛋白質(zhì)Fig.11 Grafted the polymer to protein by RAFT“grafting from”

2 結(jié)論

“活性”/可控自由基聚合技術(shù)集自由基聚合與活性聚合的優(yōu)點(diǎn)于一體，能夠設(shè)計(jì)制備符合理論計(jì)算值的分子量(MW)和窄的分子量分布(MWD)的聚合物，這一優(yōu)點(diǎn)使得“活性”/可控自由基聚合被廣泛應(yīng)用在高分子化合物和生物高分子材料等領(lǐng)域。近年來(lái)，特別是對(duì)ATRP 和RAFT 這兩種“活性”/可控自由基聚合的研究相對(duì)較多。ATRP 反應(yīng)條件簡(jiǎn)單，制備容易，但是由于產(chǎn)物中除去催化劑銅離子較困難，所以這方面的研究朝著無(wú)銅化且具有生物相容性催化劑的方向發(fā)展。RAFT 雖然反應(yīng)條件溫和且產(chǎn)物處理簡(jiǎn)單，但是RAFT 的二硫引發(fā)劑的制備困難成為它致命的缺點(diǎn)，所以RAFT 引發(fā)劑制備的研究有待發(fā)展。

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