何小珍，蔣軍輝，趙雷，徐小娜

(1.南華大學(xué) 藥學(xué)與生命科學(xué)院，湖南 衡陽 421001;2.南華大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，湖南 衡陽 421001;3.南華大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南 衡陽 421001)

野菊花為菊科植物野菊(Chrysanthemum indicum L.)的干燥頭狀花序，具有清熱解毒、舒風(fēng)平肝作用，主要用于治療疔瘡、癰腫、丹毒、風(fēng)熱感冒、咽喉腫痛、高血壓眩暈、頭痛等癥［1］?，F(xiàn)代藥理研究表明，野菊花具有廣譜抗菌、抗病毒、降壓、增加冠脈血流量、清除氧自由基等作用［2］。野菊花生物活性多樣、清香宜人、安全可靠，同時(shí)藥源廣泛、價(jià)格低廉，在藥品、食品、保健品、化妝品等諸多領(lǐng)域具有開發(fā)價(jià)值。野菊花中含有黃酮類、揮發(fā)油、多糖、二萜類和酚酸類等多種成分，主要成分為黃酮類化合物和揮發(fā)油［3-4］。揮發(fā)油是野菊花的有效成分之一，對(duì)肺炎、雙球菌、流感桿菌、金黃色葡萄球菌等均有較強(qiáng)的抑制作用［5-6］。

野菊花揮發(fā)油成分復(fù)雜，因地理環(huán)境、氣候條件和采集時(shí)間及提取方法的差別，其化學(xué)成分和顏色會(huì)有明顯的差異，其藥用的療效也有所不同。為了更好地開發(fā)利用野菊花資源，本文對(duì)產(chǎn)自安徽金寨的野菊花揮發(fā)油采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，同時(shí)結(jié)合直觀推導(dǎo)式演進(jìn)特征投影法(HELP)［7-9］進(jìn)行系統(tǒng)研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

高純氦氣、正己烷、無水硫酸鈉均為分析純;二次蒸餾水;野菊花，購于北京同仁堂長沙店，產(chǎn)地安徽金寨。

Shimadzu 2010A 型氣相色譜-QP2010 型質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)，島津質(zhì)譜工作站，NIST107 質(zhì)譜庫;Zebron ZB-5 氣相毛細(xì)管柱(30 m × 0. 25 mm ×0.25 μm);AT201 型電子天平;揮發(fā)油提取器(500 mL);D1810C 自動(dòng)雙重純水蒸餾器。

1.2 揮發(fā)油提取

藥材事先置于50 ℃烘箱中烘干，粉碎，過40 目篩。準(zhǔn)確稱取50 g 藥材粉末，置于500 mL 圓底燒瓶中，再加入300 mL 蒸餾水，浸泡12 h。按中華人民共和國藥典(2010 年版)揮發(fā)油測定法提取4 h［10］。正己烷作溶劑，收集揮發(fā)油，顏色為淡黃色。用無水硫酸鈉干燥后移入樣品瓶中，密封，保存于4 ℃冰箱。

1.3 氣相色譜-質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件色譜柱為ZB-5 熔融石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣為高純氦氣，流速1.0 mL/min;進(jìn)樣口溫度250 ℃;進(jìn)樣量1 μL，分流比1∶10;采用程序升溫:初始溫度50 ℃，保留2 min，然后以4 ℃/min 的速率升至210 ℃，保留2 min。

1.3.2 質(zhì)譜條件電子轟擊(EI)離子源，電子能量70 eV，離子源溫度200 ℃，檢測電壓0.8 kV，掃描模式為全掃描模式，掃描范圍35 ～500 amu，掃描速率0.2 scans/s。

2 結(jié)果與討論

2.1 定性分析

數(shù)據(jù)分析在Lenovo R400 個(gè)人計(jì)算機(jī)上進(jìn)行，利用Shimadzu GCMS solution 工作站，檢索NIST107質(zhì)譜庫確定各個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)。對(duì)于部分未完全分離的色譜峰，則將各個(gè)總離子流圖由qgd 文件格式轉(zhuǎn)成cdf 文件格式，然后在中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)圖譜/數(shù)據(jù)庫(中南大學(xué)中藥現(xiàn)代化研究所編)中應(yīng)用HELP法進(jìn)行解析，獲取純色譜峰和純質(zhì)譜峰，再與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫對(duì)照進(jìn)行定性，當(dāng)目標(biāo)化合物與標(biāo)準(zhǔn)物的質(zhì)譜的相似度在90%以上予以采用。

野菊花揮發(fā)油化學(xué)成分GC-MS 檢測的總離子流圖見圖1。

圖1 野菊花揮發(fā)油成分的GC-MS 總離子流圖Fig.1 The total ion current of volatile oil of Flos Chrysanthemi Indici

由圖1 可知，盡管不斷優(yōu)化色譜分離條件，但仍有許多重疊色譜峰出現(xiàn)。利用Shimadzu GCMS solution 工作站直接檢索，發(fā)現(xiàn)在重疊色譜峰的不同位置獲得不同的質(zhì)譜，在工作站直接進(jìn)行峰匹配時(shí)獲得目標(biāo)物和標(biāo)準(zhǔn)物的質(zhì)譜相似程度低，必須要利用HELP 多元分辨方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行解析?，F(xiàn)以圖1 中的峰簇P(保留時(shí)間段為17.33 ～17.70 min)為例，簡述運(yùn)用HELP 法解析重疊色譜峰的一般過程。

圖2 色譜峰P 的總離子流圖Fig.2 The total ion current curve for peak cluster P

圖3 色譜峰P 的二維數(shù)據(jù)圖Fig.3 The two-dimension curve for peak cluster P

圖4 峰簇P 的演進(jìn)特征投影圖Fig.4 The evolving latent projection graph of peak cluster P

色譜峰P 的總離子流圖(圖2)、二維數(shù)據(jù)圖(圖3)和演進(jìn)特征投影圖(圖4)都表明該峰簇至少含有3 種物質(zhì)，而且它是重疊較為嚴(yán)重的色譜峰。在GC-MS 中分析時(shí)，工作站自動(dòng)將峰簇P 垂直分割成3 個(gè)組分，但是相似度在90%以上的物質(zhì)只有1 種，其余2 種物質(zhì)的相似度都較低，使得定性分析不可靠，定量分析也不準(zhǔn)確。于是，我們將該峰簇的總離子流圖由qgd 文件格式轉(zhuǎn)變成cdf 文件格式，在中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)圖譜/數(shù)據(jù)庫中應(yīng)用HELP 分析方法進(jìn)行解析，在進(jìn)行背景扣除、數(shù)據(jù)平滑等一系列操作后，用HELP 法解析獲得的色譜圖見圖5。組分1、2、3 依次為乙酸冰片酯、5-甲基-2-(1-甲基乙烯基)-4-己烯-1-醇醋酸鹽、百里酚，目標(biāo)化合物和標(biāo)準(zhǔn)物的相似度分別是92.43%，92.62%，90.49%。

圖5 色譜峰P 的解析結(jié)果色譜圖Fig.5 The resolved chromatograms for peak cluster P

以此類推，對(duì)其它保留時(shí)間段的組分逐步進(jìn)行解析，得到野菊花揮發(fā)油的組成，結(jié)果見表1。

表1 野菊花揮發(fā)油成分分析結(jié)果Table 1 The results of composition analysis of Flos Chrysanthemi Indici

續(xù)表1

2.2 定量分析

本文采用總體積積分法［8，11］進(jìn)行定量分析，利用解析所得的標(biāo)準(zhǔn)化色譜曲線，對(duì)定性了的組分進(jìn)行總體積積分，籍此總體積之值對(duì)其作定量分析，結(jié)果見表1。相比較根據(jù)總離子流圖直接峰面積積分法來說，總體積積分法更準(zhǔn)確。峰P 二種方法獲得的結(jié)果見表2。

表2 峰簇P 的定量分析結(jié)果Table 2 Quantitative analysis results of peak cluster P

3 結(jié)論

采用GC-MS 聯(lián)用技術(shù)結(jié)合HELP 法首次對(duì)安徽野菊花的揮發(fā)油成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究，鑒定了66種化合物，占總相對(duì)含量的75.32%，化學(xué)成分主要為單萜烯類、倍半萜烯類及其含氧衍生物等，這與文獻(xiàn)［12］報(bào)道貴州產(chǎn)野菊花揮發(fā)油化學(xué)成分相近。

采用GC-MS 聯(lián)用技術(shù)結(jié)合HELP 法解析野菊花揮發(fā)油氣質(zhì)色譜重疊峰，可提高其定性定量結(jié)果的準(zhǔn)確度。

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