李錨，賀珧珈，徐莉，張后今，閆云君

(華中科技大學 生命科學與技術(shù)學院 分子生物物理教育部重點實驗室，湖北 武漢 430074)

隨著化石燃料的消耗及環(huán)境污染的日益嚴重，新型清潔可再生能源開發(fā)對人類社會可持續(xù)發(fā)展的重要性日益凸顯［1-2］，受到廣泛關(guān)注［3］。在目前已知的生物柴油制備工藝中，生物酶法生物柴油制備工藝因其反應條件溫和、無污染、原料來源豐富、反應產(chǎn)物易分離等優(yōu)點而被認為具有較好應用前景［4］。來源豐富的微生物脂肪酶作為一種高效的生物催化劑，在生物柴油制備中的應用研究已有很多報道［5-11］。但固定化酶需要的分離、純化和固定化過程復雜，游離酶又不穩(wěn)定、易失活，因此價格昂貴，極大地阻礙了生物酶法生產(chǎn)生物柴油的工業(yè)化［12］。

表面展示技術(shù)的發(fā)展，使脂肪酶能夠展示于酵母細胞表面，進而解決了生物酶法生物柴油制備工藝中存在的問題。南極假絲酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B，CALB)是一種應用廣泛的脂肪酶，且已有研究證實其與嗜熱絲孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase，TLL)在催化生物柴油制備時具有協(xié)同效應［11］。但截至目前，尚未見有將這兩種具有協(xié)同催化效應的脂肪酶共展示于酵母細胞表面并應用于催化生物柴油合成的報道。

本研究將表面共展示有CALB 與TLL 脂肪酶的畢赤酵母工程菌經(jīng)高密度發(fā)酵、冷凍離心及真空冷凍干燥制備得凍干全細胞催化劑，用于生物柴油制備，探索了反應體系、全細胞添加量、反應溫度及醇油摩爾比等反應條件，并進一步做了正交優(yōu)化。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

表面共展示CALB 與TLL 脂肪酶的畢赤酵母GS115，自制;脂肪酸甲酯標準品(C16 ∶0，C17 ∶0，C18 ∶0，C18 ∶1，C18 ∶2，C18 ∶3)，色 譜 純;PEG20000、甲醇、乙腈、丙酮、叔丁醇、正己烷、正庚烷、異辛烷、石油醚等均為分析純。

福立GC9790 氣相色譜;FID 檢測器;安捷倫HP-INNOWAX 19091-133 色譜柱;FD-1D-50 真空冷凍干燥機。

1.2 實驗方法

1.2.1 全細胞催化劑的制備 收集發(fā)酵液，4 ℃下6 000 r/min 離心5 min，棄上清，磷酸鹽緩沖液(pH 8.0，50 mmol/L)清洗2 ～3 次，用PEG20000 濃度為5%的磷酸鹽溶液重懸細胞，靜置30 min，－80 ℃預凍12 h，真空冷凍干燥24 h，收集干燥后微黃、顆粒粉狀物質(zhì)，即為凍干的全細胞。

1.2.2 轉(zhuǎn)酯化反應 在50 mL 帶塞玻璃錐形瓶中，加入大豆油2.19 g 與一定量的甲醇和有機溶劑，再加入一定量的全細胞催化劑，40 ℃，200 r/min，反應結(jié)束后，12 000 r/min 離心10 min，取上清(即得反應產(chǎn)物)，進行氣相色譜分析。

1.3 分析方法

1.3.1 酶活力的測定 采用堿式滴定法測定全細胞水解橄欖油乳化液的活力［13］。將經(jīng)離心收集或干燥后的細胞用Tris-HCl(pH 8.0，0.05 mol/L)制成細胞懸液備用。取橄欖油乳化液4 mL，Tris-HCl(pH 8.0，0.05 mol/L)5 mL，配制反應體系，40 ℃預熱5 min，加入細胞懸液1 mL(對照組加入Tris-HCl溶液1 mL)，反應10 min，加入15 mL 終止液。用0.05 mol/L NaOH 溶液滴定，記錄消耗的NaOH 溶液的體積。

酶活力單位(U)定義:40 ℃，pH 8.0 時，單位時間(即每分鐘)催化水解橄欖油產(chǎn)生1 μmol 游離脂肪酸所需的脂肪酶量定義為一個活力單位(U)。測得表面共展示CALB 與TLL 脂肪酶的畢赤酵母GS115 酶活力為1 700 U/(g-dry-cell)。

1.3.2 GC 檢測 去酶催化反應后離心得的生物柴油10 μL 溶于300 μL 十七碳內(nèi)標(1 mg/mL)，再加入正己烷290 μL，渦旋震蕩混勻。用微量進樣針吸取樣品1 μL，待氣相色譜運行穩(wěn)定，且處于準備狀態(tài)時注入進樣口，啟動設(shè)定的樣品檢測程序進行檢測。色譜儀配置:INNOWAX 毛細管柱(30 m ×0.25 mm×0.25 μm);氫火焰離子檢測器(FID);N2000 氣相色譜工作站。載氣氮氣，柱前壓0.1 MPa，氣化室溫度230 ℃，檢測器溫度280 ℃。柱溫采用一階程序升溫:初始柱溫180 ℃，以3 ℃/min 的速率升到230 ℃，再 在 該 溫 度 維 持1 min。內(nèi)標法計算生物柴油得率。

式中 Y——大豆油甲酯化得率，%;

m——脂肪酶催化大豆油各脂肪酸甲酯量，g;

M——大豆油完全甲酯化后脂肪酸甲酯量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 有機溶劑的選擇

有機溶劑體系自上世紀80 年代被美國科學家Klibanov［14］首次報道并證實了脂肪酶在該體系催化反應的可行性后，脂肪酶有機溶劑體系催化反應成為研究熱點。全細胞催化的反應體系中必須要有合適的反應溶劑才能取得較好的催化效果。圖1 列出了所選擇的不同有機溶劑介質(zhì)體系中全細胞催化劑的相對催化活力(以叔丁醇為參照)［15］。反應條件:細胞量0. 1 g，甲醇∶豆油(n/n)= 4 ∶1，40 ℃，200 r/min，72 h，溶劑50%。

圖1 反應溶劑的影響Fig.1 Effects of solvents on biodiesel production

由圖1 可知，以叔丁醇為反應介質(zhì)時，表面共展示CALB 與TLL 脂肪酶畢赤酵母全細胞催化劑表現(xiàn)出較高的催化活力，相比而言，其他有機溶劑及無溶劑的反應體系中全細胞催化活力均很低。因此，選定叔丁醇為反應溶劑。

2.2 叔丁醇添加量對全細胞催化反應的影響

反應體系中叔丁醇加入量對表面共展示CALB與TLL 脂肪酶畢赤酵母全細胞催化油脂甲醇解反應的影響見圖2。反應條件:細胞量0.5 g，甲醇∶豆油(n/n)=4 ∶1，40 ℃，200 r/min，72 h。

圖2 叔丁醇加入量的影響Fig.2 Effects of t-butanol amount on biodiesel production

由圖2 可知，當叔丁醇加入量小于底物油重20%時，油脂甲酯得率隨著叔丁醇加入量的增加呈明顯上升趨勢;當叔丁醇加入量超過底物油重20%時，油脂甲酯得率則緩慢降低。當叔丁醇添加量為底物油重20%，反應72 h，甲酯得率可達71.4%。

作為反應溶劑，叔丁醇添加量對表面共展示CALB 與TLL 脂肪酶畢赤酵母全細胞催化生物柴油制備具有十分重要的意義。叔丁醇添加量過少，甲醇與油脂溶解不均勻，且高濃度甲醇對酶毒害作用較大;叔丁醇添加量過多則會使得反應物濃度過小，降低了分子有效碰撞幾率從而使得反應速率降低。綜上，適宜的叔丁醇添加量對反應高效進行具有重要意義。實驗結(jié)果表明，最佳叔丁醇添加量為底物油重20%。

2.3 醇油摩爾比的影響

反應條件:細胞量0. 5 g，40 ℃，200 r/min，72 h，溶劑量20%，甲醇加入量對反應的影響見圖3。

圖3 醇油摩爾比的影響Fig.3 Effects of methanol/oil ratio on biodiesel production

由圖3 可知，在20%叔丁醇添加體系中，甲醇解甲酯得率隨著醇油比的增加而增加，在醇油摩爾比4 ∶1，甲酯得率最大，隨后呈緩慢下降趨勢，因此，選取醇油摩爾比4 ∶1 進行反應。

2.4 全細胞添加量的影響

反應條件:甲醇∶豆油(n/n)= 4 ∶1，40 ℃，200 r/min，72 h，溶劑量20%，全細胞添加量的影響見圖4。

圖4 全細胞添加量的影響Fig.4 Effects of whole-cell biocatalyst amount on biodiesel production

由圖4 可知，反應速率隨著全細胞添加量的增加而加快。全細胞添加量為0.6 g，反應72 h，甲酯得率可達79.32%。繼續(xù)增加全細胞添加量，甲酯得率不再增加，呈微弱下降趨勢，有研究指出這一現(xiàn)象可能與體系中傳質(zhì)阻力的增加有關(guān)［15］。從經(jīng)濟角度考慮，確定全細胞添加量為0.6 g。

2.5 水添加量的影響

脂肪酶催化的反應多發(fā)生在油水界面，水添加量的影響見圖5。反應條件:細胞量0.6 g，甲醇∶豆油(n/n)= 4 ∶1，40 ℃，200 r/min，72 h，溶劑量20%。

圖5 水添加量的影響Fig.5 Effects of water content on biodiesel production

由圖5 可知，在水添加量低于4%時，呈微弱激活效應，當添加量大于5%時，甲酯得率降低顯著。這可能是過量水的存在，使得水解副反應的發(fā)生所致。

2.6 反應溫度的影響

反應條件:細胞量0.6 g，甲醇∶豆油(n/n)=4∶1，35 ℃，200 r/min，72 h，溶劑20%，水3%，反應溫度的影響見圖6。

圖6 溫度的影響Fig.6 Effects of temperature on biodiesel production

由圖6 可知，叔丁醇介質(zhì)體系中表面共展示CALB 與TLL 脂肪酶的畢赤酵母全細胞作為催化劑適于低溫催化反應，當溫度超過45 ℃時，對酶的毒害作用顯著。綜合考率經(jīng)濟、節(jié)能原則，選取35 ℃作為最佳實驗溫度。

2.7 反應時間的影響

酶促反應是一個動態(tài)可逆過程，反應進行到一定程度，正逆反應速率達到平衡，產(chǎn)物不再增加。反應條件:細胞量0.6 g，甲醇∶豆油(摩爾比)=4 ∶1，40 ℃，200 r/min，溶劑20%，水3%，實驗考察了反應時間的影響，結(jié)果見圖7。

圖7 反應時間的影響Fig.7 Effect of reaction time on biodiesel production

由圖7 可知，甲酯得率隨著反應時間的延長而增加，24 h 前，速率增長顯著，隨后增速十分緩慢。選取24 h 為收獲時間。此時，甲酯得率80.99%。

2.8 正交優(yōu)化

用正交實驗設(shè)計對影響全細胞催化油脂甲酯得率的酶用量、醇油摩爾比、反應溫度、反應時間等因素作近一步優(yōu)化。實驗設(shè)計及結(jié)果分別見表1 與表2，方差分析見表3。

由表3 可知，較為顯著的影響因素是時間和全細胞添加量。由表2 可知，最優(yōu)反應條件組合為:A3B2C2D3，即全細胞添加量0.7 g，醇油摩爾比4 ∶1，溫度35 ℃，時間36 h。驗證實驗表明最優(yōu)條件下甲酯得率，達86.23%。

表1 正交實驗設(shè)計Table 1 Orthogonal experimental design

表2 正交實驗結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental results

表3 正交實驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of the orthogonal experiment results

3 結(jié)論

表面共展示具協(xié)同催化效應CALB 與TLL 脂肪酶的畢赤酵母全細胞的催化劑可催化叔丁醇介質(zhì)體系下油脂甲醇解生物柴油制備，優(yōu)化反應條件為:全細胞添加量0.7 g，醇油摩爾比4 ∶1，溫度35 ℃，時間36 h。在此條件下，甲酯得率可達86.23%。

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