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        具協(xié)同催化效應(yīng)的畢赤酵母全細(xì)胞催化生物柴油制備

        2014-12-23 01:04:28李錨賀珧珈徐莉張后今閆云君
        應(yīng)用化工 2014年8期
        關(guān)鍵詞:叔丁醇脂肪酶甲酯

        李錨,賀珧珈,徐莉,張后今,閆云君

        (華中科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 分子生物物理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430074)

        隨著化石燃料的消耗及環(huán)境污染的日益嚴(yán)重,新型清潔可再生能源開(kāi)發(fā)對(duì)人類(lèi)社會(huì)可持續(xù)發(fā)展的重要性日益凸顯[1-2],受到廣泛關(guān)注[3]。在目前已知的生物柴油制備工藝中,生物酶法生物柴油制備工藝因其反應(yīng)條件溫和、無(wú)污染、原料來(lái)源豐富、反應(yīng)產(chǎn)物易分離等優(yōu)點(diǎn)而被認(rèn)為具有較好應(yīng)用前景[4]。來(lái)源豐富的微生物脂肪酶作為一種高效的生物催化劑,在生物柴油制備中的應(yīng)用研究已有很多報(bào)道[5-11]。但固定化酶需要的分離、純化和固定化過(guò)程復(fù)雜,游離酶又不穩(wěn)定、易失活,因此價(jià)格昂貴,極大地阻礙了生物酶法生產(chǎn)生物柴油的工業(yè)化[12]。

        表面展示技術(shù)的發(fā)展,使脂肪酶能夠展示于酵母細(xì)胞表面,進(jìn)而解決了生物酶法生物柴油制備工藝中存在的問(wèn)題。南極假絲酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B,CALB)是一種應(yīng)用廣泛的脂肪酶,且已有研究證實(shí)其與嗜熱絲孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase,TLL)在催化生物柴油制備時(shí)具有協(xié)同效應(yīng)[11]。但截至目前,尚未見(jiàn)有將這兩種具有協(xié)同催化效應(yīng)的脂肪酶共展示于酵母細(xì)胞表面并應(yīng)用于催化生物柴油合成的報(bào)道。

        本研究將表面共展示有CALB 與TLL 脂肪酶的畢赤酵母工程菌經(jīng)高密度發(fā)酵、冷凍離心及真空冷凍干燥制備得凍干全細(xì)胞催化劑,用于生物柴油制備,探索了反應(yīng)體系、全細(xì)胞添加量、反應(yīng)溫度及醇油摩爾比等反應(yīng)條件,并進(jìn)一步做了正交優(yōu)化。

        1 實(shí)驗(yàn)部分

        1.1 試劑與儀器

        表面共展示CALB 與TLL 脂肪酶的畢赤酵母GS115,自制;脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品(C16 ∶0,C17 ∶0,C18 ∶0,C18 ∶1,C18 ∶2,C18 ∶3),色 譜 純;PEG20000、甲醇、乙腈、丙酮、叔丁醇、正己烷、正庚烷、異辛烷、石油醚等均為分析純。

        福立GC9790 氣相色譜;FID 檢測(cè)器;安捷倫HP-INNOWAX 19091-133 色譜柱;FD-1D-50 真空冷凍干燥機(jī)。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 全細(xì)胞催化劑的制備 收集發(fā)酵液,4 ℃下6 000 r/min 離心5 min,棄上清,磷酸鹽緩沖液(pH 8.0,50 mmol/L)清洗2 ~3 次,用PEG20000 濃度為5%的磷酸鹽溶液重懸細(xì)胞,靜置30 min,-80 ℃預(yù)凍12 h,真空冷凍干燥24 h,收集干燥后微黃、顆粒粉狀物質(zhì),即為凍干的全細(xì)胞。

        1.2.2 轉(zhuǎn)酯化反應(yīng) 在50 mL 帶塞玻璃錐形瓶中,加入大豆油2.19 g 與一定量的甲醇和有機(jī)溶劑,再加入一定量的全細(xì)胞催化劑,40 ℃,200 r/min,反應(yīng)結(jié)束后,12 000 r/min 離心10 min,取上清(即得反應(yīng)產(chǎn)物),進(jìn)行氣相色譜分析。

        1.3 分析方法

        1.3.1 酶活力的測(cè)定 采用堿式滴定法測(cè)定全細(xì)胞水解橄欖油乳化液的活力[13]。將經(jīng)離心收集或干燥后的細(xì)胞用Tris-HCl(pH 8.0,0.05 mol/L)制成細(xì)胞懸液備用。取橄欖油乳化液4 mL,Tris-HCl(pH 8.0,0.05 mol/L)5 mL,配制反應(yīng)體系,40 ℃預(yù)熱5 min,加入細(xì)胞懸液1 mL(對(duì)照組加入Tris-HCl溶液1 mL),反應(yīng)10 min,加入15 mL 終止液。用0.05 mol/L NaOH 溶液滴定,記錄消耗的NaOH 溶液的體積。

        酶活力單位(U)定義:40 ℃,pH 8.0 時(shí),單位時(shí)間(即每分鐘)催化水解橄欖油產(chǎn)生1 μmol 游離脂肪酸所需的脂肪酶量定義為一個(gè)活力單位(U)。測(cè)得表面共展示CALB 與TLL 脂肪酶的畢赤酵母GS115 酶活力為1 700 U/(g-dry-cell)。

        1.3.2 GC 檢測(cè) 去酶催化反應(yīng)后離心得的生物柴油10 μL 溶于300 μL 十七碳內(nèi)標(biāo)(1 mg/mL),再加入正己烷290 μL,渦旋震蕩混勻。用微量進(jìn)樣針吸取樣品1 μL,待氣相色譜運(yùn)行穩(wěn)定,且處于準(zhǔn)備狀態(tài)時(shí)注入進(jìn)樣口,啟動(dòng)設(shè)定的樣品檢測(cè)程序進(jìn)行檢測(cè)。色譜儀配置:INNOWAX 毛細(xì)管柱(30 m ×0.25 mm×0.25 μm);氫火焰離子檢測(cè)器(FID);N2000 氣相色譜工作站。載氣氮?dú)?,柱前?.1 MPa,氣化室溫度230 ℃,檢測(cè)器溫度280 ℃。柱溫采用一階程序升溫:初始柱溫180 ℃,以3 ℃/min 的速率升到230 ℃,再 在 該 溫 度 維 持1 min。內(nèi)標(biāo)法計(jì)算生物柴油得率。

        式中 Y——大豆油甲酯化得率,%;

        m——脂肪酶催化大豆油各脂肪酸甲酯量,g;

        M——大豆油完全甲酯化后脂肪酸甲酯量,g。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 有機(jī)溶劑的選擇

        有機(jī)溶劑體系自上世紀(jì)80 年代被美國(guó)科學(xué)家Klibanov[14]首次報(bào)道并證實(shí)了脂肪酶在該體系催化反應(yīng)的可行性后,脂肪酶有機(jī)溶劑體系催化反應(yīng)成為研究熱點(diǎn)。全細(xì)胞催化的反應(yīng)體系中必須要有合適的反應(yīng)溶劑才能取得較好的催化效果。圖1 列出了所選擇的不同有機(jī)溶劑介質(zhì)體系中全細(xì)胞催化劑的相對(duì)催化活力(以叔丁醇為參照)[15]。反應(yīng)條件:細(xì)胞量0. 1 g,甲醇∶豆油(n/n)= 4 ∶1,40 ℃,200 r/min,72 h,溶劑50%。

        圖1 反應(yīng)溶劑的影響Fig.1 Effects of solvents on biodiesel production

        由圖1 可知,以叔丁醇為反應(yīng)介質(zhì)時(shí),表面共展示CALB 與TLL 脂肪酶畢赤酵母全細(xì)胞催化劑表現(xiàn)出較高的催化活力,相比而言,其他有機(jī)溶劑及無(wú)溶劑的反應(yīng)體系中全細(xì)胞催化活力均很低。因此,選定叔丁醇為反應(yīng)溶劑。

        2.2 叔丁醇添加量對(duì)全細(xì)胞催化反應(yīng)的影響

        反應(yīng)體系中叔丁醇加入量對(duì)表面共展示CALB與TLL 脂肪酶畢赤酵母全細(xì)胞催化油脂甲醇解反應(yīng)的影響見(jiàn)圖2。反應(yīng)條件:細(xì)胞量0.5 g,甲醇∶豆油(n/n)=4 ∶1,40 ℃,200 r/min,72 h。

        圖2 叔丁醇加入量的影響Fig.2 Effects of t-butanol amount on biodiesel production

        由圖2 可知,當(dāng)叔丁醇加入量小于底物油重20%時(shí),油脂甲酯得率隨著叔丁醇加入量的增加呈明顯上升趨勢(shì);當(dāng)叔丁醇加入量超過(guò)底物油重20%時(shí),油脂甲酯得率則緩慢降低。當(dāng)叔丁醇添加量為底物油重20%,反應(yīng)72 h,甲酯得率可達(dá)71.4%。

        作為反應(yīng)溶劑,叔丁醇添加量對(duì)表面共展示CALB 與TLL 脂肪酶畢赤酵母全細(xì)胞催化生物柴油制備具有十分重要的意義。叔丁醇添加量過(guò)少,甲醇與油脂溶解不均勻,且高濃度甲醇對(duì)酶毒害作用較大;叔丁醇添加量過(guò)多則會(huì)使得反應(yīng)物濃度過(guò)小,降低了分子有效碰撞幾率從而使得反應(yīng)速率降低。綜上,適宜的叔丁醇添加量對(duì)反應(yīng)高效進(jìn)行具有重要意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,最佳叔丁醇添加量為底物油重20%。

        2.3 醇油摩爾比的影響

        反應(yīng)條件:細(xì)胞量0. 5 g,40 ℃,200 r/min,72 h,溶劑量20%,甲醇加入量對(duì)反應(yīng)的影響見(jiàn)圖3。

        圖3 醇油摩爾比的影響Fig.3 Effects of methanol/oil ratio on biodiesel production

        由圖3 可知,在20%叔丁醇添加體系中,甲醇解甲酯得率隨著醇油比的增加而增加,在醇油摩爾比4 ∶1,甲酯得率最大,隨后呈緩慢下降趨勢(shì),因此,選取醇油摩爾比4 ∶1 進(jìn)行反應(yīng)。

        2.4 全細(xì)胞添加量的影響

        反應(yīng)條件:甲醇∶豆油(n/n)= 4 ∶1,40 ℃,200 r/min,72 h,溶劑量20%,全細(xì)胞添加量的影響見(jiàn)圖4。

        圖4 全細(xì)胞添加量的影響Fig.4 Effects of whole-cell biocatalyst amount on biodiesel production

        由圖4 可知,反應(yīng)速率隨著全細(xì)胞添加量的增加而加快。全細(xì)胞添加量為0.6 g,反應(yīng)72 h,甲酯得率可達(dá)79.32%。繼續(xù)增加全細(xì)胞添加量,甲酯得率不再增加,呈微弱下降趨勢(shì),有研究指出這一現(xiàn)象可能與體系中傳質(zhì)阻力的增加有關(guān)[15]。從經(jīng)濟(jì)角度考慮,確定全細(xì)胞添加量為0.6 g。

        2.5 水添加量的影響

        脂肪酶催化的反應(yīng)多發(fā)生在油水界面,水添加量的影響見(jiàn)圖5。反應(yīng)條件:細(xì)胞量0.6 g,甲醇∶豆油(n/n)= 4 ∶1,40 ℃,200 r/min,72 h,溶劑量20%。

        圖5 水添加量的影響Fig.5 Effects of water content on biodiesel production

        由圖5 可知,在水添加量低于4%時(shí),呈微弱激活效應(yīng),當(dāng)添加量大于5%時(shí),甲酯得率降低顯著。這可能是過(guò)量水的存在,使得水解副反應(yīng)的發(fā)生所致。

        2.6 反應(yīng)溫度的影響

        反應(yīng)條件:細(xì)胞量0.6 g,甲醇∶豆油(n/n)=4∶1,35 ℃,200 r/min,72 h,溶劑20%,水3%,反應(yīng)溫度的影響見(jiàn)圖6。

        圖6 溫度的影響Fig.6 Effects of temperature on biodiesel production

        由圖6 可知,叔丁醇介質(zhì)體系中表面共展示CALB 與TLL 脂肪酶的畢赤酵母全細(xì)胞作為催化劑適于低溫催化反應(yīng),當(dāng)溫度超過(guò)45 ℃時(shí),對(duì)酶的毒害作用顯著。綜合考率經(jīng)濟(jì)、節(jié)能原則,選取35 ℃作為最佳實(shí)驗(yàn)溫度。

        2.7 反應(yīng)時(shí)間的影響

        酶促反應(yīng)是一個(gè)動(dòng)態(tài)可逆過(guò)程,反應(yīng)進(jìn)行到一定程度,正逆反應(yīng)速率達(dá)到平衡,產(chǎn)物不再增加。反應(yīng)條件:細(xì)胞量0.6 g,甲醇∶豆油(摩爾比)=4 ∶1,40 ℃,200 r/min,溶劑20%,水3%,實(shí)驗(yàn)考察了反應(yīng)時(shí)間的影響,結(jié)果見(jiàn)圖7。

        圖7 反應(yīng)時(shí)間的影響Fig.7 Effect of reaction time on biodiesel production

        由圖7 可知,甲酯得率隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,24 h 前,速率增長(zhǎng)顯著,隨后增速十分緩慢。選取24 h 為收獲時(shí)間。此時(shí),甲酯得率80.99%。

        2.8 正交優(yōu)化

        用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)影響全細(xì)胞催化油脂甲酯得率的酶用量、醇油摩爾比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等因素作近一步優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分別見(jiàn)表1 與表2,方差分析見(jiàn)表3。

        由表3 可知,較為顯著的影響因素是時(shí)間和全細(xì)胞添加量。由表2 可知,最優(yōu)反應(yīng)條件組合為:A3B2C2D3,即全細(xì)胞添加量0.7 g,醇油摩爾比4 ∶1,溫度35 ℃,時(shí)間36 h。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明最優(yōu)條件下甲酯得率,達(dá)86.23%。

        表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal experimental design

        表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental results

        表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of the orthogonal experiment results

        3 結(jié)論

        表面共展示具協(xié)同催化效應(yīng)CALB 與TLL 脂肪酶的畢赤酵母全細(xì)胞的催化劑可催化叔丁醇介質(zhì)體系下油脂甲醇解生物柴油制備,優(yōu)化反應(yīng)條件為:全細(xì)胞添加量0.7 g,醇油摩爾比4 ∶1,溫度35 ℃,時(shí)間36 h。在此條件下,甲酯得率可達(dá)86.23%。

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