張運(yùn)紅+劉蘭英+余金龍+吳禮樹+和愛玲+孫克剛

摘要：以小白菜（Brassica rapa chinensis）為材料，研究了復(fù)合外源活性物質(zhì)對(duì)兩種除草劑（草甘膦和2， 4-D）藥害的緩解效果。結(jié)果表明，草甘膦和2， 4-D脅迫后，小白菜葉片分別出現(xiàn)黃斑或卷葉現(xiàn)象，產(chǎn)量也有不同程度降低;而施用復(fù)合外源活性物質(zhì)后其藥害癥狀得到不同程度緩解，且二者均以稀釋800倍液處理（WY800）的效果最佳，谷胱甘肽含量和抗氧化酶活性也均有不同程度提高。該結(jié)果說明該復(fù)合外源活性物質(zhì)可一定程度緩解草甘膦和2， 4-D在小白菜上產(chǎn)生的藥害。

關(guān)鍵詞：復(fù)合外源活性物質(zhì);小白菜（Brassica rapa chinensis）;草甘膦;2， 4-D;藥害

中圖分類號(hào)：S634.3;Q945.78 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2014）21-5104-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.21.013

Effects of Composite Exogenous Substances on Reducing the Phytotoxicity of Two Herbicides in Chinese cabbage（Brassica rapa chinensis）

ZHANG Yun-hong1， LIU Lan-ying2， YU Jin-long2， WU Li-shu2， HE Ai-ling1， SUN Ke-gang1

（1.Institute of Plant Nutrition， Agricultural Resources and Environmental Science， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450002， China;2.Microelement Research Centre， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）

Abstract：The effects of composite exogenous substances on reducing the phytotoxicity of two herbicides （glyphosate and 2， 4-D） in Chinese cabbage（Brassica rapa chinensis）were studied. The results showed that Chinese cabbage seedlings had macular or rolling leaves under the stress of glyphosate or 2， 4-D. The yields were reduced. The symptoms of phytotoxicity were relieved in different degrees after applying composite exogenous substances with the optimal effects of WY800 treatment. The glutathione content and antioxidant enzyme activity of Chinese cabbage treated with composite exogenous substances were increased. It is indicated that the composite exogenous substances can reduce the phytotoxicity of glyphosate and 2， 4-D in Chinese cabbage.

Key words：composite exogenous substances; Chinese cabbage（Brassica rapa chinensis）; glyphosate; 2， 4-D; phytotoxicity

中國(guó)是世界上的蔬菜生產(chǎn)大國(guó)，不僅蔬菜種植的面積大，而且品種多，草害發(fā)生也較為嚴(yán)重。因此，除草劑在我國(guó)蔬菜生產(chǎn)中發(fā)揮著越來越重要的作用，但也存在諸多問題。據(jù)抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，除草劑使用過程中存在的最為普遍的問題就是藥害[1]。藥害不僅會(huì)使作物體內(nèi)生理過程發(fā)生變化，從而造成生長(zhǎng)受阻，植株變態(tài)，甚至死亡等，同時(shí)其農(nóng)藥殘留也危害人體健康[2]。草甘膦和2， 4-D是蔬菜種植過程中廣泛應(yīng)用的兩種除草劑，其中草甘膦屬于有機(jī)雜環(huán)類除草劑，2， 4-D屬于苯氧類除草劑，二者的不正當(dāng)使用均會(huì)產(chǎn)生藥害[2，3]。有報(bào)道，在藥害脅迫條件下，植物自身會(huì)產(chǎn)生一些生理反應(yīng)，以保護(hù)其免受藥害，但這并不能完全消除農(nóng)藥對(duì)植物的傷害[4]。最近研究顯示，噴施某些外源活性物質(zhì)可減少藥害的發(fā)生[5，6]，這為緩解作物藥害提供了一條嶄新的途徑，尋求高效、環(huán)保、經(jīng)濟(jì)的農(nóng)藥安全劑，已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。因此，以小白菜（Brassica rapa chinensis）為材料，研究了實(shí)驗(yàn)室自制的一種復(fù)合外源活性物質(zhì)對(duì)兩種除草劑（草甘膦和2， 4-D）藥害的緩解效果及作用機(jī)制。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗(yàn)材料

供試作物為小白菜（Brassica rapa chinensis），品種為上海青，購(gòu)自武漢市蔬菜種子公司。供試農(nóng)藥為草甘膦[化學(xué)名稱為N-（膦酰基甲基）甘氨酸]和2， 4-D（化學(xué)名稱為2， 4-二氯苯氧乙酸），二者分別購(gòu)自于江蘇省百靈農(nóng)化有限責(zé)任公司和浙江龍華精細(xì)化工有限公司。供試復(fù)合外源活性物質(zhì)，由本實(shí)驗(yàn)室自行研制，主要成分為從海洋生物中提取的一些活性物質(zhì)，包含可溶性分子化合物和稀土元素等。

供試土壤為紅棕壤，基本理化性質(zhì)為有機(jī)質(zhì) 19.33 g/kg，全N含量 1.35 g/kg，速效N含量45.60 mg/kg，速效P含量7.64 mg/kg，速效K含量 146.01 mg/kg，pH 5.8。

1.2 ?試驗(yàn)方案

1）藥害發(fā)生試驗(yàn)。試驗(yàn)在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)盆栽場(chǎng)進(jìn)行，采用直徑20 cm的聚乙烯塑料盆，每盆裝土1 kg。撒播，7 d后發(fā)芽，20 d后定植并進(jìn)行處理，分別按照各種農(nóng)藥大田用量標(biāo)準(zhǔn)（草甘膦為50 g/L，2， 4-D為0.03 g/L）的1倍（C1）、 2倍（C2）、 3倍（C3）稀釋液噴施小白菜，用清水作對(duì)照（CK），每個(gè)處理3次重復(fù)。施藥時(shí)將藥劑或清水均勻噴灑于小白菜正反葉面上。平均每3 d噴施一次，1周后收樣并測(cè)其鮮重。此外，處理過程中每天觀察藥害發(fā)生情況，并用相機(jī)（Canon IXUS 90IS）拍照記錄，根據(jù)魏福香[7]的方法進(jìn)行藥害分級(jí)統(tǒng)計(jì)。

2）藥害緩解試驗(yàn)。待小白菜生長(zhǎng)20 d左右，選擇較好的天氣進(jìn)行藥劑處理，2 d后噴施復(fù)合外源活性物質(zhì)，其稀釋倍數(shù)分別為1000倍（WY1000）、800倍（WY800）、600倍（WY600）和400倍（WY400）稀釋液。每個(gè)處理3次重復(fù)。各處理分別表示為：空白對(duì)照（CK），除草劑（NY），除草劑和復(fù)合外源活性物質(zhì)處理（NY+WY）。處理1周后進(jìn)行癥狀觀察，并測(cè)定株高、鮮重、葉綠素和谷胱甘肽（GSH）含量、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性。

1.3 ?指標(biāo)測(cè)定

生物學(xué)產(chǎn)量測(cè)定：用清水將植株洗凈、陰干后，用千分之一電子天平測(cè)其地上部鮮重。

葉綠素含量測(cè)定：稱取剪碎的新鮮葉片0.2 g，置于刻度試管中，加入25 mL 80%丙酮，塞蓋置于室溫下暗貯藏至組織變白。將葉綠素提取液倒入光程1 cm比色杯內(nèi)，以80%丙酮為空白對(duì)照，分別于波長(zhǎng)663、645、440 nm處測(cè)其吸光度。

GSH含量測(cè)定：參照Gronwald 等[8]的方法，稱取新鮮或冰凍的葉片0.2 g，加入1.2 mL 5%的三氯乙酸，在冰浴下研磨至勻漿，4 ℃下12 000 g離心20 min，取0.8 mL上清液，添加1.6 mL的磷酸緩沖液 （0.5 mol/L， pH=8），再加入16 μL 10 mmol/L的 5， 5-二硫代硝基苯甲酸（DTNB）顯色，于波長(zhǎng)412 nm處測(cè)定其吸光度。

酶液提?。悍Q取新鮮或冰凍的葉片0.5 g，加入5 mL預(yù)冷的50 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.8），在冰浴上研磨成漿，4 ℃下12 000 g下離心20 min，上清液即為酶粗提取液。

SOD活性測(cè)定：取酶液0.1 mL，加入3 mL反應(yīng)混合液（包含50 mmol/L、pH 7.8的磷酸緩沖液，0.14 μmol/L 1-甲硫蛋氨酸，0.74 μmol/L 氮藍(lán)四唑NBT，0.1 mmol/L EDTA-Na2和1.0 μmol/L核黃素）于37 ℃下用4 000 lx日光燈光照20 min，同時(shí)做空白試驗(yàn)（以去離子水代替酶樣品），光照完畢后迅速遮光，于波長(zhǎng)560 nm處測(cè)其吸光度，以所用磷酸緩沖液調(diào)零。以抑制NBT光還原反應(yīng)50%所需酶量為1個(gè)SOD活力單位（U）計(jì)算，SOD酶活性用U/（g·min） 表示。

CAT活性測(cè)定：取10 mL試管4個(gè)（2個(gè)測(cè)定，另2個(gè)為對(duì)照），測(cè)定試管中加入新鮮酶液2.5 mL， 對(duì)照試管中加煮死酶液2.5 mL，再分別加入2.5 mL 0.1 mol/L H2O2（30%H2O2 56.8 μL加水至10 mL），立即計(jì)時(shí)，并迅速倒入石英比色杯中，260 nm下測(cè)定吸光度，每隔1 min讀數(shù)1次，共測(cè)4 min。以每分鐘內(nèi)吸光度減少0.01的酶量為1個(gè)酶活單位（U）， CAT酶活性用U/（g·min） 表示。

POD活性測(cè)定：取50 mL 100 mmol/L磷酸緩沖液（pH 6.0），加入愈創(chuàng)木酚28 μL，加熱攪拌溶解，待溶液冷卻后加入30% H2O219 μL，混合均勻保存于冰箱中備用。取光程為1 cm玻璃比色杯2只，一只加入反應(yīng)液3 mL和20 mmol/L磷酸二氫鉀1 mL作為調(diào)零管。另一只加入反應(yīng)液3 mL和提取酶液1 mL，立即開始計(jì)時(shí)，分別于470 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色，開始記錄數(shù)據(jù)，然后每隔1 min記錄1次吸光度，共測(cè)3 min，以每分鐘吸光值變化0.01為一個(gè)酶活單位。POD酶活性用U/（g·min） 表示。

測(cè)定結(jié)果采用DPS3. 01專業(yè)版軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?草甘膦和2，4-D在小白菜上的藥害發(fā)生情況

圖1顯示，草甘膦和2， 4-D處理后小白菜均有明顯的藥害癥狀發(fā)生，其中草甘膦處理2 d后所有濃度處理均出現(xiàn)明顯黃化現(xiàn)象，其中C1黃斑面積約5%，受害程度為一級(jí);C2黃斑面積約為15%，受害程度為二級(jí);C3黃斑面積約為25%，受害程度為三級(jí)，此時(shí)3種濃度處理小白菜生長(zhǎng)未受抑制;處理4 d后，各濃度處理小白菜生長(zhǎng)均受明顯抑制，受害面積均在40%以上，具體藥害癥狀見圖1A;處理6 d后，各濃度處理的黃斑面積分別約為60%、80%和95%，受害等級(jí)分別為六級(jí)、八級(jí)和十級(jí)，且邊緣出現(xiàn)明顯焦枯失綠癥狀（圖1B），C3處理除生長(zhǎng)點(diǎn)外，整個(gè)葉片基本失綠（圖1C），產(chǎn)量也分別比對(duì)照下降41.65%、61.57%和61.27%（表1）。2，4-D處理的小白菜藥害癥狀不同于草甘膦，3種濃度處理2 d后均開始出現(xiàn)卷葉，受害面積為10%～40%;處理4 d后癥狀明顯加重，卷葉面積分別為60%、70%、80%，受害程度為六級(jí)、七級(jí)、八級(jí)，生長(zhǎng)受到輕微抑制（圖1D）;處理6 d后C1受害程度已達(dá)到九級(jí)，C2和C3受害面積已分別達(dá)到95%和100%，受害程度為十級(jí)（圖1E， 圖1F），產(chǎn)量分別比對(duì)照下降4.54%、5.14%和18.30%（表1）。

2.2 ?復(fù)合外源活性物質(zhì)對(duì)草甘膦和2，4-D脅迫下小白菜生長(zhǎng)發(fā)育的影響

噴施復(fù)合外源物質(zhì)對(duì)小白菜草甘膦和2， 4-D藥害均有明顯的緩解效果（圖2和表2）。其中小白菜經(jīng)草甘膦脅迫后，葉片出現(xiàn)黃斑，株高、鮮重、SPAD值分別較對(duì)照處理下降13.37%、35.25%和10.44%;在此基礎(chǔ)上施用復(fù)合外源活性物質(zhì)藥害癥狀得到明顯緩解，其中WY800處理效果最好，黃斑面積減少明顯，株高、鮮重和SPAD值也分別比NY處理增加24.17%、62.66%和14.13%;WY1000處理次之，WY400處理緩解效果相對(duì)最差，但仍好于NY處理。該結(jié)果說明，噴施復(fù)合外源活性物質(zhì)可緩解草甘膦藥害，且具有一定的濃度效應(yīng)，過高或者過低都不能達(dá)到最佳效果。

圖2B顯示，噴施復(fù)合外源活性物質(zhì)對(duì)小白菜2，4-D藥害也有明顯的緩解效果。其中WY800處理的緩解效果也最好，表現(xiàn)為葉片卷曲程度最小，WY600和WY1000處理的次之，WY400的緩解效果最差。因2，4-D脅迫后小白菜主要藥害癥狀是葉片卷曲，故噴施復(fù)合外源活性物質(zhì)后，對(duì)株高和鮮重影響不明顯，但WY1000、WY800和WY600處理的小白菜葉片SPAD值仍顯著高于NY處理，增幅分別為8.24%、7.53%和7.97%（表2）。

2.3 ?復(fù)合外源活性物質(zhì)對(duì)草甘膦和2，4-D脅迫下小白菜谷胱甘肽含量的影響

除草劑在作物體內(nèi)的一個(gè)重要降解途徑是與GSH軛合生成低毒或無毒的物質(zhì)，再通過體內(nèi)的運(yùn)輸系統(tǒng)將生成的物質(zhì)運(yùn)輸?shù)桨饣蛞号輧?nèi)，從而避免除草劑對(duì)作物的毒害[8]。圖3顯示，草甘膦和2，4-D脅迫后，小白菜葉片中GSH含量均顯著下降，在此基礎(chǔ)上施用復(fù)合外源活性物質(zhì)后，小白菜中GSH含量較NY處理顯著增加，且均為WY800處理效果最好，增幅分別為74.02%和23.07%。該結(jié)果說明，復(fù)合外源活性物質(zhì)可通過提高植物體內(nèi)GSH含量加快農(nóng)藥的降解，從而緩解其對(duì)植物造成的傷害。

2.4 ?復(fù)合外源活性物質(zhì)對(duì)草甘膦和2，4-D脅迫下小白菜抗氧化酶活性的影響

有研究顯示，殘留的農(nóng)藥可滲入植物組織內(nèi)部，誘導(dǎo)■的產(chǎn)生，引起膜脂過氧化，從而對(duì)細(xì)胞造成傷害，使植物生長(zhǎng)異常[9]。植物體內(nèi)的SOD、CAT和POD是細(xì)胞抵御活性氧傷害的重要保護(hù)酶，它們?cè)谇宄龊瓦^氧化物，阻止羥自由基形成，保護(hù)膜系統(tǒng)免受損傷方面起著重要作用[10]。因此，研究了復(fù)合外源活性物質(zhì)對(duì)草甘膦和2， 4-D脅迫下小白菜抗氧化酶活性的影響。結(jié)果（表3）顯示，草甘膦脅迫后，施用復(fù)合外源活性物質(zhì)后，小白菜葉片中SOD和POD活性均較NY處理有一定程度提高，其中以WY800處理效果最好，二者增幅分別為73.38%和66.92%，WY600處理次之，WY400處理的效果最差。

小白菜經(jīng)2，4-D脅迫后，葉片中SOD、POD和CAT活性也分別下降38.44%、32.36%和55.75%;在此基礎(chǔ)上噴施不同濃度復(fù)合外源活性物質(zhì)后，小白菜葉片中SOD活性均有一定程度提高，其中WY800和WY600處理效果較好，分別較NY處理提高68.92%和68.66%。WY800處理的小白菜葉片中POD和CAT活性也分別顯著高于NY處理42.09%和105.28%。WY1000和WY400處理的抗氧化酶活性與NY處理相當(dāng)，表明此濃度對(duì)2， 4-D藥害沒有明顯的緩解效果。該結(jié)果說明復(fù)合外源活性物質(zhì)可通過提高植物體內(nèi)的抗氧化酶活性，緩解草甘膦和2， 4-D藥害，且存在最佳使用濃度。

3 ?小結(jié)與討論

目前，除草劑的使用和發(fā)展已使農(nóng)田除草方法發(fā)生了根本性的變化，但它的廣泛使用日益受到經(jīng)濟(jì)和生態(tài)兩方面的制約。特別是近幾年藥害問題在我國(guó)越來越突出，已成為一個(gè)影響農(nóng)業(yè)穩(wěn)定、增產(chǎn)的重要問題。因此，農(nóng)藥安全劑的研究對(duì)農(nóng)業(yè)可持續(xù)生產(chǎn)有著重要的意義。以小白菜為材料，研究了實(shí)驗(yàn)室自行研發(fā)的一種復(fù)合外源活性物質(zhì)對(duì)目前使用較廣的兩種除草劑草甘膦和2， 4-D藥害的緩解情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，草甘膦和2， 4-D脅迫后，小白菜葉片分別出現(xiàn)黃斑或卷葉現(xiàn)象，而施用該復(fù)合外源活性物質(zhì)后其癥狀得到不同程度緩解，且均以WY800處理的效果最佳。此外，草甘膦脅迫后施用該復(fù)合外源活性物質(zhì)，小白菜的株高和鮮重也有明顯提高。該結(jié)果說明復(fù)合外源活性物質(zhì)可一定程度緩解草甘膦和2， 4-D在小白菜上產(chǎn)生的藥害。

農(nóng)藥與GSH軛合是其在植物體內(nèi)降解的一種重要機(jī)制。Lay等[11]研究了二氯乙酰胺類安全劑與硫代氨基甲酸酯類除草劑的作用方式，指出該除草劑在植物體內(nèi)首先轉(zhuǎn)化為有毒性的亞礬代謝物，安全劑則是通過增加GSH的含量和提高GSH的活性來加快解除亞礬毒性的速率。最近，趙李霞等[12]研究也發(fā)現(xiàn)安全劑R-28725也可通過增加GSH含量保護(hù)玉米免受氯磺隆藥害。本試驗(yàn)所試復(fù)合外源活性物質(zhì)同樣可顯著提高葉片中GSH含量，這可能是其緩解草甘膦和2， 4-D在小白菜上產(chǎn)生藥害的原因。此外，SOD、POD和CAT是植物在逆境條件下細(xì)胞抵御活性氧傷害的重要保護(hù)酶。張賡等[5]研究發(fā)現(xiàn)，該復(fù)合外源活性物質(zhì)可提高敵敵畏脅迫下這三種酶的活性，從而緩解其在莧菜上產(chǎn)生的藥害。本試驗(yàn)中，草甘膦和2， 4-D脅迫后，噴施該復(fù)合外源活性物質(zhì)也可不同程度提高小白菜葉片中這三種酶的活性，這也有利于加快氧自由基的清除，緩解除草劑對(duì)其造成的傷害。

本試驗(yàn)從GSH和抗氧化酶角度，初步研究了噴施復(fù)合外源活性物質(zhì)對(duì)草甘膦和2，4-D藥害的緩解效果及生理機(jī)制，為其作為新型農(nóng)藥安全劑在農(nóng)業(yè)上的推廣應(yīng)用打下了理論基礎(chǔ)。但試驗(yàn)也有不足之處，如對(duì)除草劑殘留量及在植物體內(nèi)的降解產(chǎn)物未作分析，施用復(fù)合外源活性物質(zhì)后植物體內(nèi)抗氧化酶活性和GSH增高的機(jī)制尚不明確，其含有的不同組分緩解農(nóng)藥藥害的內(nèi)源機(jī)制也不清楚，均需要進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯 ?鄭 ?威）

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（責(zé)任編輯 ?鄭 ?威）

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（責(zé)任編輯 ?鄭 ?威）