陳平+喻春明+王延周+陳繼康+盧凌霄+熊和平

摘要：利用cpSSR引物（葉綠體微衛(wèi)星）分子標記對苧麻[（Boehmeria nivea （L.） Gaudich.]屬植物進行親緣關(guān)系分析。從22對cpSSR引物中，篩選出5對在苧麻中擴增良好、條帶清晰、重復性好的引物，多態(tài)性比例為22.73%。5對引物在8份供試材料中共擴增出16條多態(tài)條帶，平均每對引物的多態(tài)性條帶為3.2條。聚類分析將這些材料分為3類，分類結(jié)果與采用葉綠體基因序列分類結(jié)果一致。

關(guān)鍵詞：苧麻[（Boehmeria nivea （L.） Gaudich.];親緣關(guān)系;cpSSR

中圖分類號：S563.1 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）21-5084-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.21.008

Screening cpSSR of Boehmeria （L.） Gaudich. and Its Application

in Studying Genetic Relationship

CHEN Ping，YU Chun-ming，WANG Yan-zhou，CHEN Ji-kang，

LU Ling-xiao，XIONG He-ping

（Institute of Bast Fiber Crops， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410205， China）

Abstract： The genetic characteristics of Boehmeria （L.） Gaudich. were analyzed with cpSSR（chloroplast microsatellites） markers. 5 cpSSR primers with excellent amplification result， good repeatability and clear amplification were selected out of 22 pairs（polymorphism rate 22.73%）. 16 polymorphic loci were detected from 8 tested varieties， with an average of 3.2 loci. The tested varieties were classified into 3 groups. The result was consistent with the result of analyzing chloroplast gene sequence.

Key words： [（Boehmeria nivea （L.） Gaudich.]; genetic relationships; cpSSR

苧麻[（Boehmeria nivea （L.） Gaudich.]是蕁麻科苧麻屬的多年生草本作物，是我國特色的纖維作物。苧麻屬約有120個種，我國有31個種12個變種[1]，這些資源含有高細度、抗病、抗蟲及抗逆等優(yōu)異基因，是苧麻育種急需的育種材料。正確理解葉綠體的起源、親緣關(guān)系對苧麻新品種選育及品種的整理和研究具有重要意義。已有研究者通過形態(tài)學[1]、細胞學[2]及核基因組RAPD等分子標記[3，4]對苧麻屬植物進行了親緣關(guān)系研究，不同方法所得結(jié)果存在一定差異。

在進化過程中，葉綠體基因組DNA與核基因組相比高度保守，適宜于進行物種的遺傳演化研究，廣泛應用于植物遺傳群體和系統(tǒng)發(fā)育分析研究。廖亮等[5]通過ITS、trnL-F序列分析和細胞核型研究苧麻屬植物的起源。但序列分析方法需要進行片段測序，對設備要求高，擴增序列要經(jīng)過連接克隆載體、轉(zhuǎn)化、鑒定等繁瑣操作，效率低。葉綠體SSR標記（cpSSR）具有SSR標記的優(yōu)點，又兼顧葉綠體基因組的特點。研究者已經(jīng)利用葉綠體分子標記分析了水稻、大豆、柑橘、小麥、煙草、落葉松等[6]植物的親緣關(guān)系。cpSSR在苧麻中的應用尚無研究報道，本研究從多種植物cpSSR引物中篩選適用于苧麻的多態(tài)性cpSSR引物，并對蕁麻及7個苧麻屬植物進行了親緣關(guān)系分析。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗材料

蕁麻及7份苧麻材料見表1，均取自國家種質(zhì)長沙苧麻圃。

1.2 ?方法

1.2.1 ?葉綠體DNA提取 ?葉綠體的分離采用Percoll密度梯度離心法，參照文獻[7]。

1.2.2 ?cpSSR分析 ?從相關(guān)文獻中檢索通用性較好的22對cpSSR引物（表2），用于建立苧麻cpSSR分子標記。cpSSR反應體系為（20 μL），包括25 ng/μL模板2 μL、10× Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP 1.5 μL、10 μmol/L引物2 μL、2 U/μL Taq酶 0.5 μL，加ddH2O至20 μL反應體系。

PCR熱循環(huán)程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，引物退火50 s（退火溫度視引物Tm值而定），72 ℃延伸50 s，30個循環(huán);72 ℃充分延伸5 min，產(chǎn)物用PAGE膠檢測。

1.2.3 ?數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析方法 ?選擇清晰且多態(tài)性較高的擴增條帶進行統(tǒng)計。相同位置有條帶的記為“1”，無條帶的記為“0”，建立“0”、“1”組成的原始矩陣。利用NTsys 2.10e軟件計的SimQual程序計算相似系數(shù)，進而采用UPGMA（非加權(quán)平均法）進行聚類分析，獲得遺傳樹狀圖。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?cpSSR引物的多態(tài)性分析

合成的22對cpSSR引物中，5對來源于茄科，4對來源于水稻，2對來源于大豆，2對來源于柑橘，9對來源于煙草。用這些引物對8份供試材料DNA進行擴增，僅有來源于茄科的2對cpSSR引物（NTCP9、NTCP40）和3對來源于煙草的cpSSR引物（CCMP2、CCMP3、CCMP10）能檢測到多態(tài)性條帶，多態(tài)性比例為22.73%。5對引物對應產(chǎn)生的多態(tài)片段分別為2、3、5、2、4個，平均位點數(shù)為3.2個。對這些引物進行了重新編號，命名為SPBC1至SPBC5。

2.2 ?聚類分析

根據(jù)各材料間cpSSR標記揭示的遺傳相似系數(shù)，采用UPGMA方法進行遺傳聚類分析，得出聚類分析圖如圖1所示。由圖1可知，各材料間遺傳相似系數(shù)最小為0.402，最大為0.887。在0.680處，可將供試材料分為3類，蕁麻單獨為一類;栽培種中苧1號和青葉苧麻為第二類;剩余的為第三類，包括大葉苧麻、懸鈴木葉苧麻、序葉苧麻、海島苧麻和赤麻。第三類在相試系數(shù)0.770處分為兩支，海島苧麻、赤麻為一支，大葉苧麻、懸鈴木葉苧麻、序葉苧麻為另一支。

3 ?小結(jié)與討論

本研究參考通用性較好的cpSSR引物，從中篩選出適用于苧麻的引物，建立苧麻cpSSR技術(shù)，并在苧麻中應用。22對cpSSR引物中共篩選出5對在苧麻中有多態(tài)性并能穩(wěn)定擴增的引物，多態(tài)性比例為22.73%，說明葉綠體SSR具有較好的通用性。從篩選出的多態(tài)性cpSSR引物來源分析，2對來源于茄科（SPBC1、SPBC2），3對來源于煙草（SPBC3、SPBC4、SPBC5）。來源于水稻和松樹的cpSSR引物未檢測到多態(tài)性，顯示了cpSSR引物具有一定的特異性，與柑橘[12]及落葉松[13]中的研究結(jié)果一致。本研究篩選出的引物數(shù)量較少，一旦有更多的引物得到開發(fā)，cpSSR技術(shù)將在苧麻起源與進化等多個研究領域得到廣泛應用。

由得到的親緣關(guān)系結(jié)果可知，中苧1號和青葉苧麻聚為一類，其形態(tài)相似，染色體數(shù)都為2n=28條，與形態(tài)學、細胞學和分子標記分類結(jié)果一致，均劃分為苧麻組。與大葉苧麻親緣關(guān)系最近的是懸鈴木葉苧麻，屬于大葉苧麻組，與邱財生等[4]利用RAPD標記研究結(jié)果一致。形態(tài)學和核基因組分子標記分類中，赤麻和海島苧麻也劃分在大葉苧麻組，其與大葉苧麻組的親緣關(guān)系較近，但本研究中赤麻、海島苧麻與大葉苧麻的親緣關(guān)系比序葉苧麻與大葉苧麻親緣關(guān)系遠。本試驗中，序葉苧麻劃入大葉苧麻組。廖亮等[5]通過ITS序列研究苧麻屬演化時也發(fā)現(xiàn)，序葉苧麻的不同個體聚入序葉苧麻和大葉苧麻等不同的分支，可能是由于組間存在雜交和基因滲透。

參考文獻：

[1] 王文采.中國苧麻校訂[J].云南植物研究，1981，3（3）：307-328.

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[3] 郭安平.RAPD分子標記重建我國苧麻屬（Boehmeria Jacq）植物親緣關(guān)系的研究[D].長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學，1999.

[4] 邱財生，程超華，趙立寧，等.用RAPD標記研究苧麻屬植物的親緣關(guān)系[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2011，50（7）：1499-1501.

[5] 廖 ?亮，李同建，劉中來，等.基于細胞學和DNA序列的苧麻與其野生近緣類群系統(tǒng)關(guān)系研究[J].作物學報，2009，35（10）：1778-1790.

[6] 王化坤，婁曉鳴，章 ?鎮(zhèn).葉綠體微衛(wèi)星在植物種質(zhì)資源研究中的應用[J].分子植物育種，2006，4（3）：92-98.

[7] 鄭建樹，喻春明，陳 ?平，等.苧麻葉綠體DNA的提取及分析[J].中國麻業(yè)科學，2013，35（5）：239-243.

[8] BRYAN G D，MCNICOLL J，RAMSAY G， et al. polymorphic simple repeat markers in chloroplast genomes of Solanaceous plants[J]. Theor Appl Genet， 1999， 99：859-867.

[9] ISHII T，Mccouch S R. Microsatellites and microsynteny in the chloroplast genomes of Oryza and eight other Gramineae species[J]. Theor Appl Genet， 2000， 100：1257-1266.

[10] XU D H，ABE J，GAI J， et al. Diversity of chloroplast DNA SSRs in wild and cultivated soybeans： Evidence for multiple origins of cultivated soybean[J]. Theor Appl Genet， 2002， 105：645-653.

[11] WEISING K，GARDNER R C. A Set of conserved PCR primers for the analysis of simple sequence repeat polymorphisms in chloroplast genomes of dicotyledonous angiosperms[J]. Genome， 1999， 42：9-19.

[12] 程運江.柑橘體細胞胞質(zhì)遺傳及葉綠體SSR引物開發(fā)[J].華中農(nóng)業(yè)大學學報，2011，30（6）：780-783.

[13] 張新葉，白石進，黃敏仁.日本落葉松群體的葉綠體SSR分析[J].遺傳，2004，26（4）：486-490.

（責任編輯 ?韓 ?雪）

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?cpSSR引物的多態(tài)性分析

合成的22對cpSSR引物中，5對來源于茄科，4對來源于水稻，2對來源于大豆，2對來源于柑橘，9對來源于煙草。用這些引物對8份供試材料DNA進行擴增，僅有來源于茄科的2對cpSSR引物（NTCP9、NTCP40）和3對來源于煙草的cpSSR引物（CCMP2、CCMP3、CCMP10）能檢測到多態(tài)性條帶，多態(tài)性比例為22.73%。5對引物對應產(chǎn)生的多態(tài)片段分別為2、3、5、2、4個，平均位點數(shù)為3.2個。對這些引物進行了重新編號，命名為SPBC1至SPBC5。

2.2 ?聚類分析

根據(jù)各材料間cpSSR標記揭示的遺傳相似系數(shù)，采用UPGMA方法進行遺傳聚類分析，得出聚類分析圖如圖1所示。由圖1可知，各材料間遺傳相似系數(shù)最小為0.402，最大為0.887。在0.680處，可將供試材料分為3類，蕁麻單獨為一類;栽培種中苧1號和青葉苧麻為第二類;剩余的為第三類，包括大葉苧麻、懸鈴木葉苧麻、序葉苧麻、海島苧麻和赤麻。第三類在相試系數(shù)0.770處分為兩支，海島苧麻、赤麻為一支，大葉苧麻、懸鈴木葉苧麻、序葉苧麻為另一支。

3 ?小結(jié)與討論

本研究參考通用性較好的cpSSR引物，從中篩選出適用于苧麻的引物，建立苧麻cpSSR技術(shù)，并在苧麻中應用。22對cpSSR引物中共篩選出5對在苧麻中有多態(tài)性并能穩(wěn)定擴增的引物，多態(tài)性比例為22.73%，說明葉綠體SSR具有較好的通用性。從篩選出的多態(tài)性cpSSR引物來源分析，2對來源于茄科（SPBC1、SPBC2），3對來源于煙草（SPBC3、SPBC4、SPBC5）。來源于水稻和松樹的cpSSR引物未檢測到多態(tài)性，顯示了cpSSR引物具有一定的特異性，與柑橘[12]及落葉松[13]中的研究結(jié)果一致。本研究篩選出的引物數(shù)量較少，一旦有更多的引物得到開發(fā)，cpSSR技術(shù)將在苧麻起源與進化等多個研究領域得到廣泛應用。

由得到的親緣關(guān)系結(jié)果可知，中苧1號和青葉苧麻聚為一類，其形態(tài)相似，染色體數(shù)都為2n=28條，與形態(tài)學、細胞學和分子標記分類結(jié)果一致，均劃分為苧麻組。與大葉苧麻親緣關(guān)系最近的是懸鈴木葉苧麻，屬于大葉苧麻組，與邱財生等[4]利用RAPD標記研究結(jié)果一致。形態(tài)學和核基因組分子標記分類中，赤麻和海島苧麻也劃分在大葉苧麻組，其與大葉苧麻組的親緣關(guān)系較近，但本研究中赤麻、海島苧麻與大葉苧麻的親緣關(guān)系比序葉苧麻與大葉苧麻親緣關(guān)系遠。本試驗中，序葉苧麻劃入大葉苧麻組。廖亮等[5]通過ITS序列研究苧麻屬演化時也發(fā)現(xiàn)，序葉苧麻的不同個體聚入序葉苧麻和大葉苧麻等不同的分支，可能是由于組間存在雜交和基因滲透。

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[7] 鄭建樹，喻春明，陳 ?平，等.苧麻葉綠體DNA的提取及分析[J].中國麻業(yè)科學，2013，35（5）：239-243.

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[12] 程運江.柑橘體細胞胞質(zhì)遺傳及葉綠體SSR引物開發(fā)[J].華中農(nóng)業(yè)大學學報，2011，30（6）：780-783.

[13] 張新葉，白石進，黃敏仁.日本落葉松群體的葉綠體SSR分析[J].遺傳，2004，26（4）：486-490.

（責任編輯 ?韓 ?雪）

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?cpSSR引物的多態(tài)性分析

合成的22對cpSSR引物中，5對來源于茄科，4對來源于水稻，2對來源于大豆，2對來源于柑橘，9對來源于煙草。用這些引物對8份供試材料DNA進行擴增，僅有來源于茄科的2對cpSSR引物（NTCP9、NTCP40）和3對來源于煙草的cpSSR引物（CCMP2、CCMP3、CCMP10）能檢測到多態(tài)性條帶，多態(tài)性比例為22.73%。5對引物對應產(chǎn)生的多態(tài)片段分別為2、3、5、2、4個，平均位點數(shù)為3.2個。對這些引物進行了重新編號，命名為SPBC1至SPBC5。

2.2 ?聚類分析

根據(jù)各材料間cpSSR標記揭示的遺傳相似系數(shù)，采用UPGMA方法進行遺傳聚類分析，得出聚類分析圖如圖1所示。由圖1可知，各材料間遺傳相似系數(shù)最小為0.402，最大為0.887。在0.680處，可將供試材料分為3類，蕁麻單獨為一類;栽培種中苧1號和青葉苧麻為第二類;剩余的為第三類，包括大葉苧麻、懸鈴木葉苧麻、序葉苧麻、海島苧麻和赤麻。第三類在相試系數(shù)0.770處分為兩支，海島苧麻、赤麻為一支，大葉苧麻、懸鈴木葉苧麻、序葉苧麻為另一支。

3 ?小結(jié)與討論

本研究參考通用性較好的cpSSR引物，從中篩選出適用于苧麻的引物，建立苧麻cpSSR技術(shù)，并在苧麻中應用。22對cpSSR引物中共篩選出5對在苧麻中有多態(tài)性并能穩(wěn)定擴增的引物，多態(tài)性比例為22.73%，說明葉綠體SSR具有較好的通用性。從篩選出的多態(tài)性cpSSR引物來源分析，2對來源于茄科（SPBC1、SPBC2），3對來源于煙草（SPBC3、SPBC4、SPBC5）。來源于水稻和松樹的cpSSR引物未檢測到多態(tài)性，顯示了cpSSR引物具有一定的特異性，與柑橘[12]及落葉松[13]中的研究結(jié)果一致。本研究篩選出的引物數(shù)量較少，一旦有更多的引物得到開發(fā)，cpSSR技術(shù)將在苧麻起源與進化等多個研究領域得到廣泛應用。

由得到的親緣關(guān)系結(jié)果可知，中苧1號和青葉苧麻聚為一類，其形態(tài)相似，染色體數(shù)都為2n=28條，與形態(tài)學、細胞學和分子標記分類結(jié)果一致，均劃分為苧麻組。與大葉苧麻親緣關(guān)系最近的是懸鈴木葉苧麻，屬于大葉苧麻組，與邱財生等[4]利用RAPD標記研究結(jié)果一致。形態(tài)學和核基因組分子標記分類中，赤麻和海島苧麻也劃分在大葉苧麻組，其與大葉苧麻組的親緣關(guān)系較近，但本研究中赤麻、海島苧麻與大葉苧麻的親緣關(guān)系比序葉苧麻與大葉苧麻親緣關(guān)系遠。本試驗中，序葉苧麻劃入大葉苧麻組。廖亮等[5]通過ITS序列研究苧麻屬演化時也發(fā)現(xiàn)，序葉苧麻的不同個體聚入序葉苧麻和大葉苧麻等不同的分支，可能是由于組間存在雜交和基因滲透。

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[4] 邱財生，程超華，趙立寧，等.用RAPD標記研究苧麻屬植物的親緣關(guān)系[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2011，50（7）：1499-1501.

[5] 廖 ?亮，李同建，劉中來，等.基于細胞學和DNA序列的苧麻與其野生近緣類群系統(tǒng)關(guān)系研究[J].作物學報，2009，35（10）：1778-1790.

[6] 王化坤，婁曉鳴，章 ?鎮(zhèn).葉綠體微衛(wèi)星在植物種質(zhì)資源研究中的應用[J].分子植物育種，2006，4（3）：92-98.

[7] 鄭建樹，喻春明，陳 ?平，等.苧麻葉綠體DNA的提取及分析[J].中國麻業(yè)科學，2013，35（5）：239-243.

[8] BRYAN G D，MCNICOLL J，RAMSAY G， et al. polymorphic simple repeat markers in chloroplast genomes of Solanaceous plants[J]. Theor Appl Genet， 1999， 99：859-867.

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（責任編輯 ?韓 ?雪）