馬文彬，王占軍，姚 拓，張玉霞，王國基

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院／草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室／中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070；2.寧夏農(nóng)林科學(xué)院荒漠化治理研究所，寧夏 銀川750002）

近10年，人類對(duì)農(nóng)產(chǎn)品的需求不斷增加，為提高產(chǎn)量致使農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中大量施用化肥，中藥材栽培中化肥施用量也居高不下。研究證實(shí)，各種形態(tài)的氮肥施入土壤后，都會(huì)形成硝態(tài)氮，導(dǎo)致土壤酸化及土壤理化性質(zhì)惡化，促使土壤中一些有毒有害污染物釋放和增加［1，2］。磷肥由于其特殊的加工工藝及原料中含有多種重金屬、有害雜質(zhì)及放射性物質(zhì)［3，4］，使土壤及作物受污染。2002年6月1日《中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（試行）》（GAP）允許限度使用化學(xué)肥料，限量使用高效、低毒、低殘留農(nóng)藥。但由于人工栽培的中藥材多為多年生藥用植物，使用化學(xué)肥料勢(shì)必造成有害成分和重金屬在中藥材中的蓄積，影響藥材品質(zhì)和下茬作物的種植［5］。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在植物根際存在能夠固定空氣中的氮?dú)猓纸馔寥懒姿?，分泌植物生長激素及防治植物病害等有益微生物菌群，被稱為植物根際促生菌［5］（PGPR）。利用PGPR制備的微生物肥料在培肥地力，提高化肥利用率，抑制農(nóng)作物對(duì)硝態(tài)氮、重金屬、農(nóng)藥的吸收，凈化和修復(fù)土壤，降低農(nóng)作物病害發(fā)生，促進(jìn)農(nóng)作物秸稈和城市垃圾的腐熟利用，保護(hù)環(huán)境以及提高農(nóng)作物產(chǎn)品品質(zhì)和食品安全等方面已表現(xiàn)出不可替代的作用［7］。為維持自然界的生態(tài)平衡及農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，應(yīng)用微生物肥料對(duì)于中藥材GAP種植具有重要意義。

甘草（Glycyrrhizauralensis）為豆科多年生草本植物，地上部分粗蛋白、粗脂肪含量高，粗纖維含量低，因根和莖均能入藥［9］，是中醫(yī)最常用的藥物之一，有“十方九草”之稱。此外還在食品和輕工業(yè)等方面廣為應(yīng)用［10］，同時(shí)對(duì)干旱地區(qū)的防風(fēng)固沙、綠化荒漠、維護(hù)生態(tài)平衡等有著重要作用［11］。由于甘草應(yīng)用廣泛，需求量連年上升，加之野生甘草資源的破壞，栽培甘草成為甘草藥材的主要來源。

目前，國內(nèi)外對(duì)甘草的研究多集中在化學(xué)成分的提取、分離和有效成分的開發(fā)及甘草的分類鑒定等方面［12］。此次研究以甘草為研究對(duì)象，利用前期從甘草及其他植物根際分離篩選的5株優(yōu)良促生菌株進(jìn)行甘草促生試驗(yàn)，測(cè)定其對(duì)甘草生長的影響，篩選出最優(yōu)菌株，為甘草GAP栽培及研制甘草根際專用生物肥提供理論和技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 供試植物

供試甘草品種為烏拉爾甘草。種子由寧夏農(nóng)林科學(xué)院荒漠化治理研究所提供。

1.2 菌株來源及特征

供試菌株為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院草地生物多樣性實(shí)驗(yàn)室提供的5株優(yōu)良促生菌，其特征見表1。

1.3 培養(yǎng)基及營養(yǎng)液

LB培養(yǎng)基［13］：酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂20g，蒸餾水1 000mL，pH 7.0。

霍 格 蘭 營 養(yǎng) 液［14］：1mol／L MgSO4·7H2O 4mL，1mol／L Ca3（PO4）22mL，1mol／L CaCl2·2H2O 10mL，1mol／L KCl 10mL，F(xiàn)e·EDTA 2mL，微量元素營養(yǎng)液2mL，Agar 2g。

微量元素營養(yǎng)液配方（500mL）：HBO30.310g，MnSO41.115g，ZnSO4·7H2O 0.430g，NaMoO4·2H2O 0.012 5g，CuSO4·5H2O 0.001 25g，CoCl20.001 25g，KI 0.037 5g。

表1 供試菌株Table1 Strains for test

1.4 研究方法

1.4.1 菌懸液制備 將LB斜面培養(yǎng)基上生長72h的5種菌分別接種于100mL LB液體培養(yǎng)基中，置于28℃，125r／min的搖床培養(yǎng)3～5d，測(cè)定D660nm值，使D660nm值均＞0.5，無菌水調(diào)節(jié)D660nm值一致（使菌數(shù)量處于同一水平），制成單一菌懸液。

1.4.2 種植 選取籽粒飽滿、大小均一的甘草種子，將種子先用75%的酒精滅菌處理15s，然后，用無菌水沖洗4～5次，再經(jīng)過0.1%HgCl2滅菌處理10min后，用無菌水沖洗干凈，將種子置于滅菌后的水瓊脂培養(yǎng)基平板中，置于25℃培養(yǎng)箱（28℃，16h光照，20 000lx，8h黑暗）中培養(yǎng)，待種子芽長1～2cm，將甘草幼苗移至裝有40mL無菌Hoagland水瓊脂半固體培養(yǎng)基的長玻璃試管（4cm×45cm）中，每個(gè)試管1株幼苗，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2d后觀察，去除移栽后死亡的幼苗。

1.4.3 接種 將1.4.1中各單一菌懸液1mL在無菌條件下接入1.4.2所培養(yǎng)的幼苗根際，接種后將試管繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。設(shè)1組為對(duì)照，每個(gè)處理5次重復(fù)。

1.4.4 測(cè)定項(xiàng)目與方法 經(jīng)過處理的幼苗培養(yǎng)40d后收獲，用無菌水洗凈根表培養(yǎng)基，測(cè)量株高及根長；剪去地上部分，利用根系掃描儀（LA2400Scanner，Epson Expression 1000XL）測(cè)定根表面積、根體積及根平均直徑；經(jīng)105℃殺青15min后在70℃下烘干至恒重，分別稱量地上和地下部分干重。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007整理數(shù)據(jù)，SPSS17.0進(jìn)行方差分析和主成分分析，采用Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 促生菌劑對(duì)甘草生長的影響

2.1.1 對(duì)株高的影響 通過測(cè)定不同促生菌劑對(duì)甘草株高的影響表明（表2），接種不同促生菌劑后，甘草株高與對(duì)照有顯著差異，增幅為17.5%～32.8%，其中Jm92最好，Jm170次之，RP1最差。方差分析表明：Jm170和Jm92與對(duì)照相比差異顯著（P＜0.05），其他處理之間差異不顯著，Jm92對(duì)甘草株高的促進(jìn)作用達(dá)到了極顯著水平（P＜0.01），較對(duì)照增加32.8%；其次為Jm170，較對(duì)照增加27.1%；RP1株高小于對(duì)照。

2.1.2 對(duì)植株生物量的影響 對(duì)甘草地上、地下生物量測(cè)定表明（表2），促生菌劑對(duì)其有明顯促進(jìn)作用，其中地上部分與對(duì)照相比增加5.8%～51.5%。Jm92最為顯著，RP1促生效果最差，但較對(duì)照相比也增加了5.8%。其中Jm92，Jm170和RS5與對(duì)照相比差異顯著（P＜0.05），而且Jm 92對(duì)地上生物量的增加達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。Jm92對(duì)地下生物量的促生效果最好，較對(duì)照增加202.3%，RS5次之，達(dá)到175.6%。Jm92、Jm170和RS5較對(duì)照差異達(dá)極顯著水平（P＜0.01），說明施用促生菌劑可增加甘草的生物量。

2.2 促生菌劑對(duì)甘草根系性狀的影響

對(duì)根表面積、根體積、根平均直徑和根長等根系指標(biāo)測(cè)定表明（表3），與對(duì)照相比，5個(gè)處理分別使甘草根表面 積 增 加 186.2%，117.4%，37.9%，176.8%，168.1%，其中，RS1的處理效果與對(duì)照相比差異極顯著（P＜0.01），除RP1外，其他處理與對(duì)照相比差異顯著（P＜0.05）。由此可見，各菌劑處理對(duì)甘草根表面積具有顯著的增加作用；各處理對(duì)根體積的促生效果明顯，較對(duì)照增加148.5%、130.3%、7.58%、121.2%和180.3%，除RP1以外其余處理較對(duì)照差異極顯著（P＜0.01）；各處理對(duì)根平均直徑影響不同，RP1，RS5和Jm92對(duì)其直徑增加明顯，較CK分別增加了36.4%，17.8%和14.7%，RS1和Jm170對(duì)直徑影響則不及對(duì)照，僅RP1與CK差異顯著（P＜0.05）。各處理對(duì)根長影響不及其他指標(biāo)顯著，但除RP1外均有增加，僅Jm170與對(duì)照差異極顯著（P＜0.01），達(dá)92.4%，其余處理較對(duì)照無顯著促進(jìn)作用。

表2 不同促生菌劑下甘草的生長Table2 Effect of PGPR inoculum on growth of Radix glycyrrhizae

表3 不同促生菌劑下甘草的根系性狀Table3 Effect of PGPR inoculum on root triaits of Radix glycyrrhizae

2.3 不同促生菌劑對(duì)甘草生長的重要性

將供試菌株的根表面積、根體積、根平均直徑、根長、株高、地上生物量和地下生物量7個(gè)性狀作為自變量，進(jìn)行主成分分析。在7個(gè)因子中，前2個(gè)因子的累積貢獻(xiàn)率已經(jīng)達(dá)到88.075%，因此，在主成分分析中只需取前2個(gè)主成分。從綜合得分及排名來分析（表4），Jm92最高，促生效果最好；RP1得分最低。

3 討論

PGPR菌既可幫助植物從環(huán)境中攝入養(yǎng)分（如聯(lián)合固氮），直接促進(jìn)植物生長，也可通過減輕或預(yù)防不良環(huán)境因素（如病原菌、重金屬等）給植物造成的傷害，從而間接促生［15］，同時(shí)可溶解土壤中某些難溶性物質(zhì)（如溶磷菌），以達(dá)到促進(jìn)植物生長、增加作物產(chǎn)量，并且提高作物品質(zhì)的效果。近年來，國內(nèi)外學(xué)者就各種接種劑對(duì)植物的促生作用進(jìn)行了大量研究，如榮良燕等［16］研究指出，復(fù)合菌肥替代20%化肥用量可使成熟期玉米地上生物量鮮重提高10%，替代20%～30%的化肥可提高4%～8%的籽實(shí)產(chǎn)量。胡江春等［17］研究表明，海洋放線菌MB－97對(duì)克服重茬大豆連作障礙具有顯著作用，對(duì)大豆有生長刺激作用，大豆田間試驗(yàn)平均增產(chǎn)15.2%。康貽軍等［18］接種PGPR對(duì)豇豆幼苗的促生作用認(rèn)為，浸種處理幼苗的株高及莖葉干物重均有增加。韓文星等［18］在燕麥上接種PGPR菌肥研究發(fā)現(xiàn)，PGPR菌肥與半量化肥配施后，燕麥主根長、根體積和根系干重均有明顯增加。目前，PGPR的作用機(jī)制尚不完全清楚，但有研究認(rèn)為，PGPR可誘導(dǎo)植物分泌生長素、溶磷菌將土壤中難溶性磷轉(zhuǎn)化為植物可吸收利用的磷、增強(qiáng)植物對(duì)病原菌和環(huán)境脅迫的抗性和耐受力等［20］。本研究利用前期篩選的優(yōu)良促生菌株對(duì)甘草的促生試驗(yàn)表明，不同接種劑均可增加甘草株高及生物量，這與席琳喬等［20］在燕麥上接種聯(lián)合固氮菌株后大多數(shù)菌株明顯促進(jìn)燕麥生長（株高、根長、根表面積和生物量）的研究結(jié)果基本一致。從國內(nèi)外學(xué)者的研究可看出，促生菌肥在田間的應(yīng)用效果存在著很大差異。有報(bào)道接種外源PGPR后，其存活、競(jìng)爭(zhēng)及促生作用受接種濃度、接種技術(shù)和土壤環(huán)境等諸多因素的影響，由此也會(huì)影響促生效果。本研究在培養(yǎng)基條件下初步篩選甘草根際促生菌，對(duì)于如何優(yōu)化各種因子，以達(dá)最佳田間接種效果還需要進(jìn)一步的深入研究。

表4 甘草主成分得分及綜合得分Table4 Principal score and general score

根系是作物吸收水分和養(yǎng)分的重要器官，是最先感受到養(yǎng)分脅迫和逆境脅迫的器官［21］，而根系表面積是根系與土壤之間進(jìn)行營養(yǎng)交換的界面，根系體積是根與土壤的接觸面積，直徑增粗可降低由供氮不足引起的細(xì)根衰老和死亡的機(jī)率［22－23］，因此，根系形態(tài)特征與植物利用土壤養(yǎng)分的效率密切相關(guān)，且根系表面積大，根體積大是磷高效利用的主要特征［24］。甘草廣泛分布于西北具鹽漬化土壤、光照強(qiáng)、溫差大和多風(fēng)沙的干旱環(huán)境中，藥用部分為干燥根及根莖，其地下根莖所占比重大于主根，且主要依靠橫走根莖上的休眠芽進(jìn)行無性繁殖，因此，根系的生長發(fā)育對(duì)甘草尤為重要。試驗(yàn)研究在甘草幼苗上接種不同促生菌劑后甘草根系表面積、體積及直徑增加明顯，由此可見，促生菌劑對(duì)根系性狀的影響充分說明PGPR可增強(qiáng)根系吸收水分、養(yǎng)分的能力，這對(duì)于生長在干旱條件下的甘草極為有利。

譚周進(jìn)等［25］證實(shí)磷是植物體內(nèi)能量傳遞和轉(zhuǎn)化的重要元素，直接或間接地影響生物固氮和固氮酶活性。研究中選用的菌株Jm92和Jm170有較高的固氮酶活性，能夠固定空氣中的氮為植物提供氮素，并且具有溶磷作用，因此，較對(duì)照菌株生長良好，尤其是這兩種菌對(duì)于甘草根的影響極為顯著，且Jm92優(yōu)于Jm170，這與菌株的固氮效應(yīng)有密不可分的關(guān)系。而Sigleton等［26］的研究認(rèn)為，一旦土壤中土著根瘤菌的數(shù)量達(dá)到一定閾值時(shí)，接種根瘤菌并不能產(chǎn)生較大的作用。因此，在土壤環(huán)境中或者甘草根瘤存在等有氮條件下，促生菌株的促生效應(yīng)是下一步研究的重點(diǎn)。

4 結(jié)論

供試菌株中Jm92，Jm170和RS1對(duì)甘草生長均表現(xiàn)出不同程度的促進(jìn)作用，在研制甘草根際專用肥中具有較大潛力，但田間的應(yīng)用效果還需進(jìn)一步研究。由于PGPR是從植物根際篩選出來，再次回歸到植物根際，不僅可減少化肥對(duì)土壤的污染及對(duì)微生物區(qū)系的破壞，還可增加藥材產(chǎn)量，避免化肥使用過多而導(dǎo)致的藥材安全問題。因此，微生物接種劑的使用具有社會(huì)和生態(tài)雙重意義，為GAP種植開辟新路徑。

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