金 鹿 閆素梅 史彬林 石惠宇 郭曉宇 李俊良

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，呼和浩特 010018)

氧化應激是指細胞暴露于高濃度氧分子或氧的化學衍生物而引起的細胞損傷［1］。當機體遭受到體內(nèi)外各種有害刺激時，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)平衡失調(diào)，自由基的產(chǎn)生量會遠遠超過機體的清除能力，抗氧化系統(tǒng)不能及時的清除就會導致過多的自由基，從而導致氧化應激［2］。奶牛由于泌乳期間的高代謝率，往往會產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，導致乳腺的氧化應激，尤其對于高產(chǎn)奶牛［3］。奶牛乳腺上皮細胞(bovine mammary epithelial cells，BMEC)是乳腺組織的主要構(gòu)成細胞，是乳脂和乳蛋白合成與分泌的重要場所，其細胞的生物合成能力決定了奶牛乳腺的產(chǎn)奶能力［4］。由于奶牛泌乳期間代謝旺盛，BMEC是乳腺組織受到氧化應激首先攻擊的細胞［5］。因此，BMEC是建立奶牛氧化應激模型的理想組織細胞，建立一個成功可靠的BMEC氧化應激模型，對于揭示氧化應激機制、研究有效的抗氧化措施、提高抗氧化功能和產(chǎn)奶性能具有重要的意義。過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)是一種重要的活性氧，極易穿過細胞膜，與細胞內(nèi)亞鐵離子(Fe2+)通過Fenton反應形成高活性的自由基，導致一系列反應，因H2O2容易獲得，性質(zhì)相對穩(wěn)定，操作簡單，是目前研究各類細胞氧化損傷的重要工具［1］。目前，以H2O2為應激源構(gòu)建細胞氧化損傷模型的報道中，關(guān)于H2O2作用濃度與時間的 差 別 較 大。 韓 飛 等［6］用 10、100 和1 000μmol/L H2O2作用人肝癌細胞(HepG2)4 h后，結(jié)合細胞存活率及對DNA損傷程度結(jié)果，選擇100μmol/L作為HepG2細胞氧化模型的適宜濃度。彭亮等［7］選用人的臍靜脈內(nèi)皮細胞為試驗材料，最終選擇1 000μmol/L H2O2作用1 h來構(gòu)建其氧化損傷模型。由此可見，不同的細胞對于抵抗外界應激源的反應敏感程度不同，所以構(gòu)建氧化損傷模型使用的H2O2作用濃度與作用時間也不同?？梢?，目前大多數(shù)氧化應激模型的建立都集中于肝細胞或者是醫(yī)學領(lǐng)域的心肌細胞，對于BMEC的氧化應激模型建立的研究鮮見，而關(guān)于建立BMEC氧化損傷模型的判別標準的研究則尚未見報道。鑒于此，本試驗通過研究H2O2的作用濃度和作用時間對BMEC存活率和抗氧化指標的影響，研究建立BMEC氧化損傷模型，為進一步深入研究BMEC的氧化應激機制和抗氧化措施奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液、膠原酶Ⅱ、胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)、雙抗均購自美國Gibco公司;H2O2、表皮生長因子、氫化可的松、催乳素、兩性霉素B均購自美國Sigma公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)均購自美國Amresco公司;谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 試劑配制

H2O2原液的配制方法:35%H2O2濃度約為10 mol/L。取l mL稀釋到10 mL，配制成濃度為1 mol/L(1 000 mmol/L)的H2O2原液，按照試驗要求配制成不同濃度的H2O2貯備液(0、100、200、400、600、800和1 000 mmol/L)。在試驗開始前，用不同濃度的H2O2貯備液配制成含不同濃度H2O2的細胞培養(yǎng)液，保證各濃度培養(yǎng)液中加入的H2O2溶液體積相等，使得細胞培養(yǎng)液中除H2O2濃度不同外，其他成分都相同。

細胞培養(yǎng)液的配制:將20μL不同濃度的H2O2貯備液加入到 19.98 mL的 DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，使反應體系培養(yǎng)液中H2O2作用濃度分 別 為 0、100、200、400、600、800 和1 000μmol/L。配制好的液體用0.22μm的過濾器過濾，每次換液時現(xiàn)配。

1.3 BMEC 的培養(yǎng)

奶牛乳腺組織取自于內(nèi)蒙古呼和浩特市北亞清真冷庫，采用膠原酶消化法獲得BMEC。具體為將采集的健康的黑白花奶牛乳腺組織迅速帶回實驗室，減去外層組織，取里層組織塊裝入含3×雙抗的磷酸鹽緩沖液(PBS)的貯液瓶中，轉(zhuǎn)入超凈臺中經(jīng)含3×雙抗的PBS清洗3遍、75%醫(yī)用酒精(30 s)清洗1遍、含1×雙抗的PBS清洗3遍后，用眼科剪剪去乳腺組織塊的表面部分，于深層腺泡多的地方剪取1 mm3大小的小塊裝入5 mL的離心管中，充分剪碎后加入等體積的0.5%的膠原酶Ⅱ，置于37℃的培養(yǎng)箱中消化1 h，每隔20 min拿出輕輕搖晃離心管1次，使小組織塊充分消化。消化液用80目的細胞濾網(wǎng)過濾，收集濾液于15 mL的離心管中，1 300 r/min離心5 min后，移去上清。然后用PBS重新懸浮細胞，1 300 r/min離心3 min后，再次吸棄上清，培養(yǎng)液重新懸浮細胞后接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)中培養(yǎng)。待原代細胞80%～90%貼壁長滿培養(yǎng)瓶瓶底時，用0.05%胰蛋白酶/EDTA消化傳代細胞。

將傳至第3代貼壁生長的BMEC接種于96孔細胞培養(yǎng)板和60 mm培養(yǎng)皿中，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)液(含1μg/mL氫化可的松、0.5%胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒鈉、10 ng/mL表皮生長因子、5μg/mL催乳素)直至80%～90%細胞貼壁后進行后續(xù)試驗。

1.4 試驗設計

本試驗分2部分進行。試驗一采用單因子完全隨機試驗設計，將第3代貼壁生長的BMEC隨機分為42個組，每個組10個重復。細胞中分別添加 0、100、200、400、600、800 和 1 000 μmol/L H2O2，使之分別作用 2、4、6、8、12 和 24 h，測定細胞數(shù)量，計算存活率。其中，0μmol/L組為對照組。以細胞存活率為主要指標初步篩選H2O2作用時間和作用濃度。

試驗二是采用試驗一篩選得出適宜H2O2作用時間(6 h)，采用單因子隨機試驗設計，將第3代貼壁生長的BMEC隨機分為7組，每組6個重復，BMEC 中添加不同濃度的 H2O2(0、100、200、400、600、800 和 1 000 μmol/L)，使 H2O2作用于細胞6 h后，收集細胞和培養(yǎng)液測定抗氧化指標，進一步篩選使細胞發(fā)生氧化損傷的適宜H2O2作用濃度。其中，0μmol/L組為對照組。

1.5 樣品采集

細胞培養(yǎng)液樣品采集:BMEC培養(yǎng)6 h后，從每組的每個重復中吸取細胞培養(yǎng)液，分別收集于1.5 mL Eppendof管中，12 000 r/min 離心 10 min，收集上清液用于CAT和SOD活性的測定。

用于酶活性測定的細胞樣品采集:BMEC培養(yǎng)6 h后，棄上清，在每培養(yǎng)皿中加入1 mL PBS清洗貼壁生長的BMEC 2遍，棄去液體，加入動物細胞裂解液后放置于冰上冰浴30 min，用細胞刮板刮取貼壁細胞，收集細胞懸液到1.5 mL Eppendorf管中，4℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液用于細胞中GPx活性和MDA含量的測定。

1.6 測定指標及方法

1.6.1 存活率

存活率采用噻唑藍(MTT)法測定，以吸光度值反映細胞的數(shù)量。將細胞懸液以1×104個/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板，按上述試驗設計培養(yǎng)24 h后，各培養(yǎng)孔加入MTT(5 mg/mL)20μL;4 h后，棄上清液，甩板并拍干液體，每孔加入DMSO 100μL，用全自動酶標儀設置程序振蕩10 min，而后檢測各孔490 nm波長下的吸光度值(OD490nm)。根據(jù)下列公式計算存活率。

1.6.2 抗氧化指標

GPx活性采用二硫代二硝基苯甲酸法測定，CAT活性采用比色法測定;SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測定;MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定，具體操作過程按照試劑盒說明書進行。

1.7 試驗數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)經(jīng)Excel進行整理和計算，試驗數(shù)據(jù)采用SAS 9.0分析軟件的方差分析(ANOVA)程序進行顯著性檢驗和多重比較，P＜0.05表示差異顯著，0.05＜P≤0.10 表示差異趨于顯著，P＞0.10表示差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 H 2O 2作用濃度和作用時間對BMEC數(shù)量的影響

由表1可見，在所有作用時間下，H2O2作用濃度對BMEC數(shù)量均有顯著的影響(P＜0.05)，并且隨著H2O2作用濃度的增加，細胞的吸光度值均依次顯著減小，即細胞數(shù)量顯著降低(P＜0.05)。與對照組相比，當H2O2作用濃度為100μmol/L時，作用時間在2～8 h均未對細胞數(shù)量造成顯著影響(P＞0.10);作用 12和 24 h，細胞數(shù)量顯著減少(P＜0.05)，存活率分別為 93.62%和 92.48%。當H2O2作用濃度增加到200～400μmol/L時，除4和8 h作用時間外，其他各作用時間的細胞數(shù)量均顯著低于對照組(P＜0.05)。當H2O2作用濃度達到600μmol/L時，所有作用時間的細胞數(shù)量與對照組相比均顯著減少(P＜0.05)，2、4、6、8、12 和24 h 細 胞 存 活 率 分 別 為 87.30%、91.94%、79.79%、76.34%、60.00%和 49.27%，而且當作用時間在6 h以上時，其細胞數(shù)量顯著低于0～400 μmol/L組(P＜0.05)。當 H2O2作用濃度增加到800、1 000μmol/L時，所有作用時間的細胞數(shù)量均急劇減少，顯著低于其他各組(P＜0.05)，細胞的存活率分別從2 h的57.54%和56.35%降低到24 h的38.11%和20.15%，細胞死亡率高達40%～80%。

隨著H2O2作用時間的延長，不同濃度H2O2組細胞數(shù)量呈不同的變化規(guī)律。H2O2作用4 h與作用2 h相比，所有濃度H2O2組細胞數(shù)量均呈升高趨勢;作用6～8 h，與4 h相比，所有濃度 H2O2組細胞數(shù)量均呈降低趨勢;然而，作用12～24 h，600～1 000μmol/L組的細胞數(shù)量隨著H2O2作用時間的延長逐漸減弱，而100～400μmol/L組的細胞數(shù)量隨著時間的延長反而升高。其中，細胞存活率在70%～80%范圍內(nèi)的H2O2作用濃度與作用時間分別是:800μmol/L H2O2作用細胞4 h、600μmol/L H2O2作用細胞6 h、600μmol/L H2O2作用細胞 8 h，細胞的存活率分別為 73.15%、79.79%和 76.34%。

“一帶一路”國家倡議的提出，必然需要大批復合型英語專業(yè)人才，這是復合型英語專業(yè)的人才培養(yǎng)的機遇和挑戰(zhàn)[3]?！耙粠б宦贰背h視野下國際貿(mào)易法律復合人才法律英語教學是以培養(yǎng)國際化人才為目標的高端人才培養(yǎng)活動，因此，必須要以國際化的先進的教學理念為指引，針對“一帶一路”建設現(xiàn)實需要，根據(jù)國際貿(mào)易實踐對貿(mào)易、外語、法律人才的新需求，及時調(diào)整人才培養(yǎng)模式和教學大綱，以素質(zhì)教育和能力本位教育理論為基礎(chǔ)，構(gòu)建了“一帶一路”建設“外語+”、“貿(mào)易+”、“法律+”人才培養(yǎng)的多維互動模式[4]，將國際化人才培養(yǎng)理念貫穿于法律英語教學的始終。

表1 H 2 O 2作用濃度和作用時間對BMEC數(shù)量的影響Table 1 Effects of concentration and action time of H2O2 on BMECs count OD490 nm

2.2 H 2 O 2作用濃度對BMEC抗氧化指標的影響

由表2可見，隨著H2O2作用濃度升高，細胞GPx活性顯著下降(P＜0.05)，其中，以 600～1 000μmol/L組較低，顯著低于其他各組(P＜0.05)，但 600、800和 1 000 μmol/L 組之間無顯著差異(P＞0.10);對照組最高，顯著高于其他各組(P＜0.05);100、200和 400 μmol/L 組居中。

600～1 000μmol/L的H2O2作用濃度引起培養(yǎng)液CAT和SOD活性顯著下降(P＜0.05)，顯著低于其他各組，但600、800和1 000μmol/L組之間差異不顯著(P＞0.10);400μmol/L組的培養(yǎng)液CAT和SOD活性顯著低于對照組和100μmol/L組(P＜0.05)，與200μmol/L 組之間無顯著的差異(P＞0.10)。從總趨勢看，對照組的培養(yǎng)液CAT和SOD活性最高，100、200和400μmol/L組居中，600、800和1 000μmol/L組較低。

細胞MDA含量與上述GPx、CAT、SOD活性出現(xiàn)相反的變化規(guī)律。H2O2作用濃度為600～1 000μmol/L時，細胞MDA含量較高，顯著高于對照組及100～400μmol/L組(P＜0.05)，但這 3組比較無顯著的差異(P＞0.10);作用濃度為400μmol/L時，細胞MDA含量顯著高于對照組和100μmol/L組(P＜0.05)，但與 200 μmol/L 組之間無顯著的差異(P＞0.10)。由此得出，600、800和1 000μmol/L組的細胞MDA含量較高，其次為100、200和400μmol/L組，對照組最低。

表2 H 2O 2作用濃度對BMEC抗氧化指標的影響Table 2 Effects of action concentration of H 2 O2 on antioxdant paramaters of BMECs

3 討論

H2O2是一種重要的ROS，極易穿過細胞膜，與細胞內(nèi)Fe2+通過Fenton反應形成高活性的自由基(·OH)，導致一系列反應，因H2O2容易獲得，性質(zhì)相對穩(wěn)定，操作比較簡單，所以它是目前應用最為廣泛的氧化損傷模型的應激源，是研究各類細胞氧化損傷時使用的主要方法之一［1］。然而，以H2O2為刺激源誘導建立細胞氧化應激模型的方法在醫(yī)學領(lǐng)域應用較多，如體外培養(yǎng)的心肌細胞及肝臟細胞，關(guān)于建立BMEC的氧化應激損傷模型的研究報道極少。而且，以H2O2為應激源構(gòu)建細胞氧化損傷模型的報道中，判斷氧化應激是否發(fā)生所選擇的判別指標與判別標準不同。一些研究認為，MTT法具有特異性強、重復性好、快速、準確等優(yōu)點，通過測定其吸光度值的大小即可反映出細胞數(shù)量的多少，也可反映出細胞增殖的快慢，進而可以作為建立氧化應激模型的判別指標［8－9］，但目前選擇的判別標準不完全相同。Huo等［10］報道在小鼠的心肌細胞中，選取細胞存活率為40%～50%作為H2O2氧化損傷模型的依據(jù)。Wei等［11］研究表明，以H2O2氧化誘導鼠嗜鉻細胞瘤，以細胞死亡率為25%作為建立氧化損傷模型時選擇H2O2適宜濃度的判別標準。孫婧陶等［12］指出，以細胞死亡率為50%～60%作為建立延邊奶山羊BMEC氧化損傷模型的判別標準。周麗娜［13］的研究指出，細胞死亡率為20%～30%可以作為建立小鼠脊髓神經(jīng)元細胞氧化應激模型的評判標準。由此可見，可能是由于細胞的種類不同，對氧化損傷的耐受能力不同，因此選擇的細胞存活率判別標準不同，所報道的H2O2作用濃度與作用時間的差別也較大。通常，在建立氧化應激模型時，細胞的存活率都不宜過高或過低，若存活率過低，說明大量的細胞已經(jīng)死亡，會造成細胞不可恢復的損傷，不利于抗氧化機制的研究;若存活率過高，說明細胞是處于相對長勢比較好的狀態(tài)，細胞的活力也較好，氧化后不會造成明顯的損傷，也不利于后續(xù)試驗的開展［14］。由此說明，建立細胞氧化損傷模型時需要使細胞達到適宜的損傷程度。

此外，氧化應激指標的變化是判斷細胞是否發(fā)生了氧化應激、是否可建立細胞氧化應激模型的主要依據(jù)，是建立細胞氧化應激損傷模型的關(guān)鍵。除了細胞存活率外，GPx、SOD和CAT活性以及MDA含量可反映出機體清除自由基的能力以及脂質(zhì)過氧化損傷的程度，因此，也可以作為判斷細胞是否發(fā)生氧化應激的指標［15－16］。楊家軍等［17］研究了斷奶對仔豬腸上皮細胞的氧化損傷的影響，以SOD、CAT和GPx等酶的活性和MDA的含量作為反映機體氧化損傷的指標，結(jié)果表明，在21日齡時，與哺乳組仔豬相比，斷奶組仔豬的腸上皮細胞中SOD、CAT和GPx等抗氧化酶的活性顯著降低，過氧化產(chǎn)物MDA含量顯著升高，其腸上皮細胞也發(fā)生了明顯的損傷。李永義［18］研究了體外仔豬淋巴細胞氧化模型的建立，發(fā)現(xiàn)添加200～800μmol/L H2O2后，GPx、SOD 活性顯著降低，MDA含量顯著升高，400μmol/L H2O2可對體外仔豬的淋巴細胞產(chǎn)生明顯的氧化應激。韓飛等［6］研究表明，100和1 000μmol/L H2O2能夠顯著降低HepG2中SOD、CAT活性，提高MDA含量，而100μmol/L H2O2的對于SOD、CAT活性及MDA含量無顯著的影響，選擇100μmol/L H2O2構(gòu)建了氧化應激模型。然而，齊曉龍等［14］用 0.5～8.0 mmol/L的H2O2誘導產(chǎn)蛋雞的原代肝細胞后，MDA含量隨著H2O2作用濃度的增加而增加，SOD和CAT的活性呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，最終選擇4 mmol/L的H2O2作為構(gòu)建應激模型的濃度。Wijeratne 等［19］研究表明，用 50、100、150、200和250μmol/L H2O2誘導人的病態(tài)的結(jié)腸細胞后發(fā)現(xiàn)，SOD活性在50μmol/L H2O2作用時達到最高，CAT活性在50～250μmol/L作用時保持不變，GPx活性隨著H2O2作用濃度的增加而升高。由此可見，不同的細胞在發(fā)生氧化應激刺激后，對抗氧化酶活性的影響規(guī)律是相似的，但最終選擇的H2O2作用濃度與作用時間不完全相同，這可能與細胞的種類、研究目的不同有很大的關(guān)系。

在此基礎(chǔ)上，試驗二又以抗氧化指標GPx、SOD、CAT活性和MDA含量為判別依據(jù)，以H2O2的作用時間為6 h，進一步研究了不同濃度的H2O2對細胞抗氧化酶活性的影響，以進一步確定建立細胞氧化損傷模型時適宜的H2O2作用濃度。結(jié)果顯示，600～1 000μmol/L組與對照組相比均顯著降低了GPx、SOD和CAT活性，提高了MDA含量，與400μmol/L組比較差異顯著，但 600、800和1 000μmol/L組之間差異不顯著。由此可見，600μmol/L H2O2即可對BMEC產(chǎn)生明顯的氧化應激，可以作為建立氧化損傷模型時的作用濃度，作用濃度再繼續(xù)增加，相關(guān)指標的組間無顯著差異。H2O2引起細胞產(chǎn)生氧化損傷的原因是氧自由基和H2O2會啟動脂質(zhì)過氧化反應的發(fā)生，進而產(chǎn)生更多的自由基，隨著氧化和抗氧化過程的不斷進行，造成機體抗氧化能力的耗竭，導致氧化和抗氧化的嚴重不平衡［21］，從而造成了機體的氧化損傷，細胞內(nèi)產(chǎn)生的大量的自由基破壞了生物膜影響了酶的活性，加速蛋白質(zhì)的分解，進而影響抗氧化酶的活力、導致抗氧化能力的降低［22］。還有研究指出，機體內(nèi)抗氧化酶活力的降低是終產(chǎn)物H2O2的反饋作用或超氧陰離子(·O－2)使其滅活，這被認為是機體自身在環(huán)境因素下的保護效應［23］。因此，綜合本試驗的細胞存活率和抗氧化指標結(jié)果得出，以H2O2為應激源，其作用濃度為600μmol/L、作用時間為6 h可以引起B(yǎng)MEC的氧化損傷，可以作為建立BMEC氧化損傷模型的適宜條件。

4 結(jié)論

① 細胞存活率和抗氧化指標(GPx、SOD和CAT活性及MDA含量)可以作為判別BMEC是否發(fā)生氧化應激的指標。

② 600μmol/L H2O2作用BMEC 6 h，可以作為建立BMEC氧化損傷模型的適宜條件。

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