劉蘇俊 徐艦 趙斌 朱惠軍 孫焱 徐瑾 沈宏

非標(biāo)記定量技術(shù)研究特應(yīng)性皮炎患者血清的差異蛋白

劉蘇俊 徐艦 趙斌 朱惠軍 孫焱 徐瑾 沈宏

目的應(yīng)用非標(biāo)記定量技術(shù)研究特應(yīng)性皮炎患者血清中的差異表達(dá)蛋白,篩選特異性蛋白質(zhì)標(biāo)記物。方法收集特應(yīng)性皮炎患者和健康對(duì)照者的血清各6份,處理和提取血清蛋白質(zhì),經(jīng)一維SDS-PAGE和蛋白膠內(nèi)酶解獲得肽段,應(yīng)用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜鑒定,使用Mascot軟件查詢(xún)并用Scaffold軟件作相對(duì)定量分析。結(jié)果特應(yīng)性皮炎患者組和健康對(duì)照組的血清共檢測(cè)出76種差異表達(dá)超過(guò)1.5倍的蛋白質(zhì),患者組血清表達(dá)上調(diào)的有50種蛋白質(zhì),表達(dá)下調(diào)的有26種蛋白質(zhì),其中有26種蛋白質(zhì)僅在患者組表達(dá),14種蛋白質(zhì)僅在對(duì)照組表達(dá)。結(jié)論特應(yīng)性皮炎患者與健康人血清間存在蛋白質(zhì)表達(dá)差異。

皮炎,特應(yīng)性;蛋白質(zhì)組學(xué)

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是一種近年來(lái)常用的一種發(fā)現(xiàn)疾病特異性分子的檢測(cè)方法,常用的有基于二維凝膠電泳的蛋白質(zhì)組學(xué)分析(2D-DIGE)等,該方法存在一些局限性,分辨率不夠高,樣本需要量多且操作較復(fù)雜［1］。本文擬通過(guò)非標(biāo)記(label-free)定量蛋白質(zhì)組技術(shù)這一較新的高通量檢測(cè)方法對(duì)特應(yīng)性皮炎患者血清進(jìn)行檢測(cè),以期發(fā)現(xiàn)一些新的特異性蛋白,為進(jìn)一步深入研究特應(yīng)性皮炎的發(fā)病機(jī)制等提供一定的依據(jù)。

一、對(duì)象

6例特應(yīng)性皮炎患者為我院門(mén)診或住院患者,男女各3例,年齡4～11歲,根據(jù)Hanifin-Rajka診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為特應(yīng)性皮炎,SCORAD評(píng)分介于51～72分之間。對(duì)照血清來(lái)自年齡和性別匹配的6位健康自愿者,無(wú)特應(yīng)性疾病史,目前未患其他疾病。所有血清采集均經(jīng)過(guò)受采者監(jiān)護(hù)人知情同意?；颊呓M及對(duì)照組均于清晨空腹采集肘靜脈血3 ml,置于干燥、無(wú)抗凝劑的離心管內(nèi),4℃靜置2 h,4℃1 200×g離心10 min,分裝200 μl血清并于-80℃低溫保存。

二、主要試劑和儀器

Proteominer試劑盒(美國(guó)Bio-Rad公司),Bradford定量試劑盒(美國(guó)Bio-Rad公司),測(cè)序級(jí)胰蛋白酶(美國(guó)Promega公司),色譜純乙腈(德國(guó)MERCK公司),甲叉丙烯酰胺、碘乙酰胺和色譜純甲酸(美國(guó)FLUKA公司),IPGphor等電聚焦儀(美國(guó)Amersham公司),Etan Daltsix電泳儀(美國(guó)Amersham公司),Imagescanner凝膠成像儀(美國(guó)Amersham公司),Image-Master凝膠分析軟件(美國(guó)Amersham公司),激光顯微切割儀(美國(guó)Arcturus公司),反相液相色譜柱(美國(guó)Michrom公司),質(zhì)譜儀LTQ-Orbitrap(美國(guó)熱電公司),納升級(jí)高效液相色譜儀 LC-20AD及微量自動(dòng)進(jìn)樣器SIL-20AC(日本島津公司)。

三、方法

1.蛋白處理:血清樣品置冰上室溫溶解。從患者組和對(duì)照組每組的6個(gè)血清標(biāo)本中各取100 μl混合,形成兩個(gè)組各600 μl混合血清。嚴(yán)格按照Proteominer試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作,以去除高豐度蛋白質(zhì)。用改良的Bradford法測(cè)定收集蛋白樣品中的蛋白質(zhì)濃度。

2.一維SDS-PAGE:用7 cm的12%小膠電泳2 h,考馬斯亮藍(lán)染色并脫色過(guò)夜后,出現(xiàn)清晰的蛋白條帶。

3.蛋白膠內(nèi)酶解:將蛋白條帶從凝膠切下,切碎后(約1 mm×1 mm)置于96孔板中。加入200 μl 100 mmol/L碳酸氫銨溶液/50%乙腈脫去考馬斯亮藍(lán)染料。用200 μl乙腈將凝膠脫水至白色顆粒狀。加入12.5 mg/L胰蛋白酶溶液覆蓋凝膠顆粒,4℃放置30 min,使凝膠完全泡脹。加25 μl 25 mmol/L碳酸氫銨溶液覆蓋膠粒,置于37℃控溫?fù)u床內(nèi)16 h。取出冷卻至室溫后加入3 μl甲酸終止反應(yīng)。用50 μl 0.1%三氟乙酸(TFA)/50%乙腈提取2次,每次超聲5 min,合并2次提取液。用Speed-vac真空濃縮后,每樣品用20 μl水/0.1%甲酸溶解。

4.液相色譜分離:反相液相色譜柱的反相柱為75 μm×15 cm(Magic AQ C18 填料,3.5 μm 粒徑,2 000 ? 孔徑),流動(dòng)相A水/0.1%甲酸,B乙腈/0.1%甲酸,流速300 nl/min。梯度程序:0～5 min,B相為2%;5～95 min,B相由5%升至35%;95～96 min,B相升至90%;96-101 min,保持90%;101～103 min,B相由90%降為2%,103～120 min,保持2%。樣品以9 600×g離心10 min后放入進(jìn)樣瓶中,由儀器自動(dòng)進(jìn)樣15 μl。設(shè)定批處理程序,經(jīng)高效液相色譜分離直接通過(guò)納電噴霧接口進(jìn)入自動(dòng)串級(jí)質(zhì)譜分析(Auto-MS/MS)。

5.LTQ-Orbitrap的參數(shù)設(shè)置:電噴霧電壓1 800 V;MS掃描范圍350～1 800 Da;每次掃描選擇10個(gè)強(qiáng)度最高的母離子進(jìn)行MS/MS掃描。實(shí)驗(yàn)部分于復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院指導(dǎo)完成。

6.數(shù)據(jù)庫(kù)搜索:通過(guò)Mascot軟件2.3版本進(jìn)行查詢(xún),ESI所得結(jié)果用MSConverter(Proteowizard平臺(tái),華盛頓州大學(xué),美國(guó))進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換為mgf文件。搜索參數(shù)設(shè)置:數(shù)據(jù)庫(kù)為瑞士 SWISSPROT;檢索種屬為人,Homo Sapiens［human］;母離子質(zhì)量偏差容忍度25 ppm,碎片質(zhì)量偏差容忍度0.6 Da;最大允許漏切位點(diǎn)為2;酶為胰蛋白酶;甲硫氨酸氧化和蛋白質(zhì)N端乙?；癁榭勺冃揎?。用Scaffold(3.4.3版本,Proteome Software公司,美國(guó))軟件計(jì)算搜庫(kù)結(jié)果的置信度,肽段和蛋白的置信度是通過(guò)PeptideProphet和ProteinProphet(系統(tǒng)生物學(xué)研究所,美國(guó))算法分別計(jì)算。通過(guò)選擇置信度高于90%為接受標(biāo)準(zhǔn),最終結(jié)果的假陽(yáng)性率小于5%。

7.相對(duì)定量分析:Scaffold軟件同時(shí)也用于相對(duì)定量分析,對(duì)于每一張得到鑒定的譜圖都把置信度納入考慮后,計(jì)算得到每一個(gè)蛋白的定量值。定量方法是經(jīng)過(guò)修改的譜圖計(jì)數(shù)法。

表1 特應(yīng)性皮炎患者和對(duì)照血清中差異大于2倍的蛋白質(zhì)

四、結(jié)果

患者組及對(duì)照組樣品分別進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有高度的相似性。選擇3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中均鑒定到的蛋白質(zhì)做進(jìn)一步的差異倍數(shù)統(tǒng)計(jì)分析。以差異倍數(shù)大于1.5倍作為參考標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)蛋白質(zhì)。本研究中,特應(yīng)性皮炎患者組和健康對(duì)照組的血清共檢測(cè)出181種蛋白質(zhì),其中患者組167種,對(duì)照組155種,兩者共有蛋白質(zhì)為141種。患者組高表達(dá)的有50種蛋白質(zhì),低表達(dá)的有26種蛋白質(zhì),其中有26種蛋白質(zhì)僅在患者組表達(dá),14種蛋白質(zhì)僅在對(duì)照組表達(dá)。表1列出差異大于2倍及僅在對(duì)照組或者患者組出現(xiàn)的差異蛋白質(zhì)。差異大于1.5倍而小于2倍的比較重要的蛋白還有細(xì)胞外超氧化物歧化酶、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶、補(bǔ)體因子B、視黃醇結(jié)合蛋白4、血清淀粉樣蛋白A1、α1抗糜蛋白酶和基膜聚糖等。

五、討論

定量蛋白質(zhì)組學(xué)可以精確測(cè)量多個(gè)不同生理或病理?xiàng)l件下生物樣本中蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化［2］。非標(biāo)記定量是其中一種較為常用的研究方法,一般多為相對(duì)定量,實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單,對(duì)樣本的操作少,在檢測(cè)肽段的數(shù)量、蛋白質(zhì)的覆蓋率和分析通量方面具有較大優(yōu)勢(shì),但在進(jìn)行相對(duì)定量時(shí),低豐度蛋白不易檢測(cè)。

蛋白質(zhì)組學(xué)常用于腫瘤類(lèi)疾病中某些標(biāo)志物的檢測(cè)。國(guó)內(nèi)已有學(xué)者在瘢痕疙瘩［3］和銀屑病［4］等皮膚病的研究中,應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了疾病的某些特異性蛋白。

本文應(yīng)用非標(biāo)記定量技術(shù)對(duì)特應(yīng)性皮炎患者和健康對(duì)照血清進(jìn)行比較蛋白組學(xué)研究,檢測(cè)到了76種明顯差異表達(dá)的蛋白?；颊呓M高表達(dá)的有50種蛋白質(zhì),其中26種僅在患者組表達(dá)。對(duì)照組高表達(dá)的有26種蛋白質(zhì),有14種僅在對(duì)照組表達(dá)。本研究中發(fā)現(xiàn)的樣本總蛋白數(shù)量比較少,可能與樣本處理和蛋白提取等過(guò)程中部分蛋白丟失有關(guān),這需要在以后研究中改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法。

研究中發(fā)現(xiàn)的差異蛋白主要與免疫、炎癥、感染及增殖和分化等有關(guān),現(xiàn)對(duì)其中一些蛋白進(jìn)行初步討論,這些蛋白將作為我們后續(xù)研究的重點(diǎn)。

細(xì)胞外超氧化物歧化酶(extracellular superoxide dismutase,EC-SOD)不僅能清除超氧化物,保護(hù)組織免受炎癥損傷,而且還可以在免疫反應(yīng)過(guò)程和信號(hào)啟動(dòng)中有重要的調(diào)節(jié)作用［5］。本研究結(jié)果中患者血清中EC-SOD較健康對(duì)照組明顯下降,提示EC-SOD下降可能與特應(yīng)性皮炎患者明顯的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

彈性蛋白結(jié)合蛋白(Ficolin-2)是由肝臟合成并分泌至血液中,能夠激活補(bǔ)體的凝集素途徑［6］,在針對(duì)金黃色葡萄球菌、肺炎球菌、沙門(mén)菌等細(xì)菌的天然免疫中有重要作用。Cedzynski等［7］在兒童患者中發(fā)現(xiàn)血清Ficolin-2的下降與合并過(guò)敏性疾病的呼吸道感染有關(guān),且與過(guò)敏的關(guān)系比感染的關(guān)系更密切。本研究發(fā)現(xiàn),特應(yīng)性皮炎患者血清中的Ficolin-2水平較健康對(duì)照明顯下降。特應(yīng)性皮炎患者皮損表面常出現(xiàn)的金黃色葡萄球菌定植或感染,可顯著加重特應(yīng)性皮炎的病情,這是否與其血清中的Ficolin-2水平下降有關(guān)值得進(jìn)一步研究。

有研究發(fā)現(xiàn),腱糖蛋白(Tenascin)基因［8］和蛋白［9］在特應(yīng)性皮炎皮損的表達(dá)明顯升高。本研究發(fā)現(xiàn),其在血清中亦明顯升高,提示腱糖蛋白在特應(yīng)性皮炎的發(fā)病中有一定作用。

單核細(xì)胞分化抗原(CD14)的159C/T基因多態(tài)性與特應(yīng)性哮喘的易感性有關(guān)［10］,CD14-159 C/T基因型的血清可溶性CD14水平升高［11］。本研究中特應(yīng)性皮炎患者血清的可溶性CD14水平顯著升高,可能與特應(yīng)性皮炎的發(fā)病有相關(guān)性。

在本研究檢測(cè)到的特應(yīng)性皮炎患者血清比健康對(duì)照高表達(dá)的52種蛋白中,有很多蛋白是與細(xì)菌感染和炎癥等有關(guān),如N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶、補(bǔ)體因子B、視黃醇結(jié)合蛋白4等。還有些蛋白如角蛋白1、角蛋白2、角蛋白9、角蛋白10以及角質(zhì)形成細(xì)胞分化相關(guān)蛋白與維持皮膚角質(zhì)層的完整性有關(guān)。

2008年有學(xué)者對(duì)特應(yīng)性皮炎患者血漿中糖蛋白用2DDIGE方法進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究［12］,發(fā)現(xiàn)16種蛋白在特應(yīng)性皮炎中表達(dá)上調(diào)或下調(diào)。其中,有2個(gè)蛋白在本研究中也被發(fā)現(xiàn)。血紅素結(jié)合蛋白在特應(yīng)性皮炎血漿表達(dá)下調(diào),與本研究一致。纖維蛋白原γ鏈在上述研究中為血漿低表達(dá),而本研究中為血清高表達(dá),可能與血漿和血清標(biāo)本不同及檢測(cè)方法不同等因素有關(guān)。

我們應(yīng)用非標(biāo)記定量技術(shù)研究了特應(yīng)性皮炎患者血清的蛋白質(zhì)組,得到一些差異表達(dá)蛋白。這些差異蛋白還需要在大樣本量的研究證實(shí)。

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Application of label-free quantitative proteomics in the screening for differentially expressed serum proteins in patients with atopic dermatitis

Liu Sujun，Xu Jian，Zhao Bin，Zhu Huijun，Sun Yan，Xu Jin，Shen Hong.Department of Dermatology，Third People's Hospital of Hangzhou，Hangzhou 310009，China

Shen Hong，Email:shenhangzhou@sina.com

Objective To screen differentially expressed serum proteins by label-free quantitative proteomics in patients with atopic dermatitis，in order to discover serum protein markers for atopic dermatitis.Methods Serum samples were collected from 6 patients with atopic dermatitis and 6 healthy human controls.Then，the samples from the patients were pooled together，so with those from the controls.Proteins were extracted from the two joint serum samples followed by separation with one-dimensional sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis(SDS-PAGE).Peptides were obtained by enzymolysis in protein gels，which were subsequently identified by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry.The Mascot software was used for database searching，and the Scaffold software for relatively quantitative analysis of proteins.Results Totally，76 proteins with a difference of greater than 1.5 folds were identified between the serum samples of patients with atopic dermatitis and controls.There were 50 up-regulated and 26 down-regulated serum proteins in the patients compared with the healthy controls.Among these differentially expressed proteins，26 were only detected in the sera of the patients，and 14 proteins in those of the controls.Conlusion Differences exist in the expression of serum proteins between atopic dermatitis patients and healthy people.

Dermatitis，atopic；Proteomics

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.08.016

浙江省自然科學(xué)基金(Y2091229)

310009杭州市第三人民醫(yī)院皮膚科

沈宏,Email:shenhangzhou@sina.com

2013-12-23)

(本文編輯:顏艷)