黃梅桂，張曉鳴

1(南京林業(yè)大學，輕工科學與工程學院，江蘇省制漿造紙科學與技術重點實驗室，江蘇南京，210037)2(江南大學食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)

美拉德反應(Maillard reaction)又稱為“非酶褐變反應”，主要是指食品中羰基化合物(還原糖類)與氨基化合物(如氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、胺等)在加工和儲藏過程中在一定溫度下發(fā)生的復雜反應［1］。它不僅為加工食品帶來誘人的色澤，而且也產(chǎn)生濃郁芳香氣味，如咖啡、可可豆的焙炒、肉類食品的蒸煮以及面包等食品的烘烤。大量文獻［2-4］表明，國內(nèi)外對美拉德熱反應的研究大多集中在增強食品香氣(如焦甜香、肉香)，以及增強其誘人的美拉德褐色物質(zhì)。但鮮有研究控制美拉德反應程度，特別是研究日常調(diào)味所用的食鹽(NaCl)對美拉德反應具有怎樣的影響。

NaCl是人們常用的調(diào)味劑，研究NaCl對大豆肽美拉德反應的色澤影響，對于充分利用我國的大豆資源，開發(fā)風味多樣的美拉德反應風味增強肽，拓展大豆肽在食品中的應用，促進人類的健康具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

大豆分離蛋白(蛋白質(zhì)含量為86．7%)，購于上海滬峰生物科技有限公司;Alcalase 2．4 L，購于諾維信酶制劑公司;其他試劑均為分析純。

WSC測色色差計，上海精密科學儀器有限公司);UV-1600紫外可見分光光度計，上海美譜達公司;氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(Finnigan Trace GC/MS)，F(xiàn)innigan;高效液相色譜儀，Waters Co．，Milford。

1.2 實驗方法

1．2．1 大豆肽的制備

大豆分離蛋白按1∶8(g∶mL)溶于水中，85℃預處理20 min，用 0．5 mol/L NaOH 調(diào)節(jié) pH 值至 8．0，添加0．5%Alcalase，60℃恒溫酶解4h后，升溫至90℃滅酶10 min。酶解物9 000 g離心15 min，取上清液凍干備用。

1．2．2 美拉德反應產(chǎn)物的制備

大豆肽 0．1 g/mL，D-木糖 0．015 g/mL，L-半胱氨酸0．01 g/mL溶于蒸餾水中，分別按質(zhì)量的0．5%，1% ，2% ，3% ，4%，5% ，7% ，10% 添加 NaCl，0．1 mol/L NaOH 或0．1 mol/L HCl調(diào)節(jié) pH 值至 7．0，120 ℃油浴攪拌反應2h。取出冰浴，猝滅反應，供分析用。

1．2．3 色差測定

以水做空白對照，定量移取2 mL MRPs用于測定 L*，a*，b*值。3次測定取平均值［5］。

總色差△E=(△L*2+△a*2+△b*2)1/2

彩度C*=(a*2+b*2)1/2

色調(diào)H=arctan(b*/a*)

1．2．4 感官評定

MRPs按質(zhì)量的0．15%添加到鮮湯溶液中，加熱到60℃，將樣品3位數(shù)編碼后根據(jù)肉香、焦甜香、咸味、鮮味、醇厚味、持續(xù)性以及整體接受性進行感官評定，添加等量的糊精鮮湯作為空白溶液，打分標準為1～7的組成及呈味參照物詳見文獻［6-7］。

1．2．5 分子量分布測定

樣品制備:樣品溶解于流動相中，高速離心(10 000 g)10 min，用 0．45 μm 微孔過濾膜過濾后供進樣;色譜條件詳見文獻［7］。

1．2．6 揮發(fā)性成分分析

揮發(fā)性組分的固相微萃取(SPME):樣品中揮發(fā)性組分采用固相微萃取方法(SPME)進行提取，具體的方法、氣相色譜條件及質(zhì)譜條件詳見文獻［7］。

2 結果與討論

2.1 NaCl的添加對大豆肽-木糖-半胱氨酸體系(PXC)色澤的影響

NaCl作為調(diào)味或防腐保鮮劑廣泛存在于各類食品中，NaCl添加量對PXC美拉德反應體系色澤形成的影響如圖1所示。

圖1 NaCl添加量對大豆肽-木糖-半胱氨酸美拉德反應產(chǎn)物色差的影響Fig．1 Effect of NaCl on color formation in Maillard reaction

從圖1色差測定結果可知，L*先增大后減小，a*、b*、ΔE和C*值均出現(xiàn)先減小后增大的規(guī)律，在NaCl添加量4．00%時具有轉(zhuǎn)折點值，L*最大值為51．30，與未添加 NaCl(0．00%)的產(chǎn)物 L*值 41．64相比顯著增大，a*、b*、ΔE和 C*的最小值分別為7．65、52．16、52．01、52．72。

通過光譜法測定MRPs在420 nm下的吸光度，結果如表1所示。隨著NaCl添加量的增大，A420呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢，在4．00%時具有最小值(0．084)。綜合色差值及A420值，可以看出NaCl在一定濃度下具有抑制色澤形成的作用。Kawk［8］認為這可能是因為在反應初始階段，氨基酸非離子化的氮對羰基的親核加成反應活性高，一定濃度的NaCl改變了大豆肽兩端氨基羧基的離子化狀態(tài)［9］，在反應過程中起到了一定的調(diào)節(jié)作用，減緩美拉德反應中氨基的降解及聚合作用，進而減緩高級階段類黑精等呈色物質(zhì)的形成［10］。濃度過高使產(chǎn)物色澤更深，發(fā)生這種現(xiàn)象的原因還不明確，有待進一步研究。

表1 NaCl添加量對大豆肽-木糖-半胱氨酸美拉德反應產(chǎn)物A420的影響Table 1 Effect of NaCl on A420in Maillard reaction

2.2 相對分子質(zhì)量分布

按4%NaCl的添加量制備MRPs，得到顏色相對較淺PXCN。研究NaCl的添加對大豆肽-木糖美拉德體系反應產(chǎn)物屬性的影響，采用HPLC對PXCN(添加NaCl)和PXC(未添加NaCl)的相對分子質(zhì)量分布進行分析，根據(jù)各個不同相對分子質(zhì)量肽段對美拉德反應的貢獻，采用GPC軟件將其切分為4段，相對分子質(zhì)量＞5 000的組分、相對分子質(zhì)量1 000～5 000的組分、相對分子質(zhì)量為500～1 000和相對分子質(zhì)量＜500的組分，如圖2所示，相對分子質(zhì)量＜500的組分在產(chǎn)物中的比例近60%，是MRPs的重要組分，是揮發(fā)性香氣成分的主要來源。與體系PXC相比，PXCN體系中小于500的肽段顯著降低，從61．15%下降到59．73%。相對分子質(zhì)量1 000～5 000的產(chǎn)物從 15．56% 增加到 16．63%，Ogasawara 等［11］認為1 000～5 000段的美拉德肽具有提升特征風味(醇厚感和持續(xù)感)的作用。而大分子物質(zhì)一般認為是棕色化物質(zhì)(類黑精或蛋白黑素)與美拉德產(chǎn)物的色澤相關，與PXC(0．20%)相比，PXCN相對分子質(zhì)量在5 000以上的肽段含量增大到0．51%。

2.3 揮發(fā)性成分分析

采用SPME-GC-MS對添加NaCl前后的MRPs的揮發(fā)性化合物進行了分析，總離子流圖如圖3所示。

在譜圖上添加NaCl的體系PXCN的峰個數(shù)比未添加NaCl的體系明顯減少，且各峰峰面積差異較大，這意味著兩種美拉德產(chǎn)物的揮發(fā)性成分組成和含量均有很大差異。

為便于比較2種MRPs的揮發(fā)性成分差異，按化合物對香氣的貢獻整理為8大類，分別為醇類、酸類、醛類、酮類、酯類、呋喃類、含氮化合物及含硫化合物，與未添加抑制劑的體系PXC相比，8類物質(zhì)的含量差異較大，如圖4所示。

圖2 添加NaCl前后相對分子質(zhì)量分布的HPLC圖Fig．2 Molecular weight distribution of MRPs by HPLC

圖3 兩種美拉德產(chǎn)物的揮發(fā)性成分總離子流圖Fig．3 total ion chromatogram of volatile compounds of MRPs

圖4 MRPs的揮發(fā)性成分比較Fig．4 Comparation of volatile compounds of MRPs

本實驗中經(jīng)鑒定的含氮化合物主要為(吡啶、吡咯)吡嗪類化合物，吡嗪類化合物是一類美拉德反應形成的主要揮發(fā)性化合物之一，具有烤香與堅果風味［12］，包括吡嗪、甲基吡嗪、2，5-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪等。PXC的含氮化合物含量與PXCN之間無顯著性差異，分別為 1．37 μg/g 和 1．12 μg/g。呋喃類包括呋喃、呋喃酮等，是美拉德反應中的另一大類主要產(chǎn)物。不含硫的呋喃類化合物主要呈現(xiàn)甜香和堅果香，雖不具有肉香特征，但對肉香有重要的作用［13］。體系 PXC 12．87 μg/g，PXCN 為 11．47 μg/g。Limacher等［14］證實了呋喃經(jīng)過完整的糖鏈或C2和C3片斷重新組合的形成過程。大豆肽中存在的蘇氨酸、丙氨酸和絲氨酸等也可通過乙醇醛、乙醛等C2片斷形成呋喃。在水溶液中，約50%的呋喃是通過糖片斷的重新組合而產(chǎn)生的。

揮發(fā)性含硫化合物中硫醚與二硫醚具有突出的肉香氣特征［15］。PXC和PXCN的含硫化合物分別為7．35、6．80 μg/g，NaCl的添加在一定程度上抑制了含硫化合物的產(chǎn)生。PXCN的醛類化合物含量尤其高，達 16．47 μg/g，PXC 體系中的含量為 11．91 μg/g。體系中的醇類酸類酯類也有較大差異，醇類化合物的含量按由高到低的順序為PXC ＞PXCN，酸類高低順序為PXC＞PXCN，酯類含量為PXC＞PXCN。一般認為醛類化合物是某些重要的特征香氣成分的來源，而醇、酸、酯類對肉香氣沒有貢獻，但它們中的某些化合物是形成雜環(huán)化合物的重要來源，因此它們對肉香形成具有不可忽視的基底作用。整體而言，添加NaCl后揮發(fā)性化合物的種類及含量均有極大的影響，NaCl體現(xiàn)出對該體系香氣化合物的產(chǎn)生具有抑制作用。

2.4 感官評定

為了進一步研究NaCl對的大豆肽-半胱氨酸-木糖體系的整體風味的影響，對2種MRPs的感官屬性進行評價，結果如圖5所示。與對照物PXC體系相比，PXCN的肉香、醇厚味及整體接受性均較弱。PXCN焦甜香和咸味較強，PXC整體接受性較強可能是由于各種化合物之間存在相互影響(增強、抑制或輔助)，化合物之間良好的協(xié)調(diào)從而產(chǎn)生了較強的整體接受性。這與GC-MS測定的PXC中含有豐富種類及含量的揮發(fā)性化合物的結果相一致，由此可見，該體系中NaCl的添加僅適合于適當調(diào)節(jié)美拉德產(chǎn)物的色澤和開發(fā)咸味類食品，而對開發(fā)風味濃厚的美拉德風味調(diào)味料并不適合。

圖5 MRPs的感官輪廓圖Fig．5 sensory profile of MRPs

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