王鑫，郭瑞琳，王派麗，孟穎，魏靜，許丹丹，宋天雪

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱，150076)

透明質(zhì)酸又稱玻璃酸(hyaluronic acid，HA)，是一種天然的具有保水功能的酸性黏多糖［1］。廣泛存在于動物和人體的組織細(xì)胞間質(zhì)(基質(zhì))和某些細(xì)菌的莢膜中，具有保持皮膚彈性的功能，能夠鎖住大量水分子，對皮膚組織具有保濕潤滑的作用［2］。HA分子構(gòu)造為一線性、并無分支的高分子。分子質(zhì)量能夠達(dá)到100～150萬。低分子質(zhì)量HA具有促進(jìn)血管生成的活性，保護(hù)人體內(nèi)肉芽組織免受氧自由基的破壞，并且能夠促進(jìn)傷口愈合［3-4］。高分子質(zhì)量HA可以抑制巨噬細(xì)胞的吞噬能力，而低分子質(zhì)量HA可促使巨噬細(xì)胞表達(dá)一些與炎癥有關(guān)的因子［5］。低分子質(zhì)量HA能滲透到真皮層，調(diào)節(jié)皮膚代謝，促進(jìn)血液循環(huán)，有保健、美白作用，低分子質(zhì)量HA幾乎與用于任何種類化妝品［6］。因此，研究高效的降解出低分子質(zhì)量的HA，使得HA的吸收利用率增加，既含有低分子HA的特性，也能達(dá)到高分子HA的作用效果，才更有助于其特殊作用的發(fā)揮［7］。本文采用化學(xué)法對純化后的HA進(jìn)行降解研究，并應(yīng)用響應(yīng)面法對降解條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高產(chǎn)品的利用度。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器或材料與設(shè)備

新鮮雞冠市售;HA標(biāo)品，上海源葉生物科技有限公司;CTAB，北京中生瑞泰科技有限公司;三氯甲烷，天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心;正丁醇，天津市福晨化學(xué)試劑廠;NaCl，天津市北方醫(yī)化學(xué)試劑廠;葡萄糖，天津市進(jìn)豐化工有限公司;鐵氰化鉀，天津市北辰方正試劑廠;VC，天津市津北精細(xì)化工有限公司;H2O2，天津市化工消毒用品有限公司;NaCO3，天津市晶科化工有限公司;無水乙醇，天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

微型植物粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司;R-205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海申勝生物技術(shù)有限公司;恒溫水浴鍋，余姚市東方電氣儀器廠;SHZ-Dバ循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司;TU-1900型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;ALC-1100.2型電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;便攜數(shù)顯電子PH計(jì)測試筆，北京市立精化學(xué)器具有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取0.025 0 g標(biāo)準(zhǔn)HA于25 mL容量瓶中，定容至刻度，配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別量取HA標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 置于10 mL 容量瓶中，定容至刻度。以蒸餾水作為空白，在波長為198 nm處測定吸光度。以HA濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 HA提取工藝

將新鮮的公雞冠用無水乙醇浸泡24 h至雞冠變硬為止，將雞冠干燥后粉碎。加入雞冠粉末6～7倍蒸餾水，攪拌均勻，靜置浸泡12 h，收集濾液，濾渣再按同樣方法浸泡2次，合并濾液。將濾液不斷攪拌，每100 mL濾液加入10 g的固體NaCl，完全溶解后，加入與濾液等體積的三氯甲烷、正丁醇溶液(三氯甲烷∶正丁醇體積比為4∶1)，連續(xù)攪拌2 h左右，采用分液漏斗靜置分層取上層水相待用。取上述待用水相于燒杯中用體積分?jǐn)?shù)90%乙醇浸泡，按照1∶2的比例將二者混合靜置沉淀24 h，回收乙醇溶液，沉淀物干燥得HA粗品。

1.2.3 HA純化方法

HA粗提物溶于0.15 mol/L NaCl中得到0.25%的HA溶液。1倍體積10%CTAB(溶在0.15 mol/L NaCl中)加入4倍體積的0.25%的HA溶液中。調(diào)節(jié) pH=9.0，靜置 4h。CTAB與 HA生成CTAB-HA復(fù)合物沉淀，離心分離。CTAB-HA復(fù)合物浸泡在1.5 mol/L NaCl溶液中，置于60℃水浴中靜置2 h。CTAB-HA復(fù)合物可解離溶解。最終得到較純的HA液體，干燥后待用。純化后HA含量計(jì)算公式:

式中:W，HA 含量，%;m，HA 質(zhì)量，g;M，純化后物質(zhì)量，g。

1.2.4 糖還原法測定產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量

以0.3 mol/L的Na2CO3溶液為溶劑，配制濃度為0.75 mg/mL的鐵氰化鉀溶液。采用分析純葡萄糖配制濃度為1 mg/mL的溶液，并作5個(gè)梯度稀釋。取各稀釋液2 mL，與2 mL上述鐵氰化鉀溶液于比色管中混合均勻后在沸水浴上反應(yīng)15 min，冷卻，在420 nm波長下測吸光度。以吸光值為縱坐標(biāo)，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。HA的降解產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量的計(jì)算公式:

式中:α，降解產(chǎn)物濃度，mg/mL;β，葡萄糖濃度，mg/mL。

1.2.5 降解HA單因素條件的選擇

1.2.5.1 H2O2和VC最佳比例的確定

量取5份HA粗品溶液每份5 mL，加入1 mL 0.1 mol/L的VC，用NaOH調(diào)節(jié)pH至4.0，分別加入2、3、4、5、6、0.1 mol/L 的 H2O2溶液，反應(yīng)開始，維持pH在4.0，反應(yīng)15 min。分別取各燒杯中反應(yīng)液2 mL，與2 mL鐵氰化鉀-碳酸鈉溶液于比色管中混合均勻，在沸水浴上反應(yīng)15 min冷卻。在420 nm波長下測吸光度，根據(jù)糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算分子質(zhì)量。

1.2.5.2 pH值對降解的影響

量取5份HA粗品溶液每份5 mL，加入1 mL 0.1 mol/L的 VC，用 NaOH 調(diào)節(jié) pH 值在4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，再加入4 mL 0.1 mol/L 的 H2O2溶液，反應(yīng)開始，維持pH恒定，反應(yīng)15 min，之后方法同1.2.5.1。

1.2.5.3 降解時(shí)間對HA降解的影響

量取5份HA粗品溶液每份5 mL，加入1 mL 0.1 mol/L的VC，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.0，再加入4 mL 0.1 mol/L的H2O2溶液，反應(yīng)開始，維持pH值恒定，反應(yīng) 5、10、15、20、25 min，之后方法同1.2.5.1。

1.2.5.4 H2O2濃度對降解的影響

量取5份HA粗品溶液各5 mL，加入1 mL 0.1 mol/L的VC，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.0，分別加入4 mL 1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mol/L 的 H2O2溶液，反應(yīng)開始，維持pH值在8.0，反應(yīng)5 min，之后方法同1.2.5.1。

采用Box-Behnken模型，以提取時(shí)間、料液比和乙醇濃度為影響透明質(zhì)酸為主要的考察因子(自變量)，分別以 X1、X2、X3表示，并以 +1、0、-1 分別代表自變量的高、中、低水平，按方程X1=Xi-X0/X對自變量進(jìn)行編碼［8］。其中Xi為自變量的編碼值，Xi為自變量的真實(shí)值，Xo為試驗(yàn)中心點(diǎn)處自變量的真實(shí)值，X為自變量的變化步長［9］，因子編碼及水平見表1。并采用多元回歸分析，擬合二次多項(xiàng)式回歸模型的Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)，進(jìn)行結(jié)果分析。在模型擬合出的最優(yōu)條件下進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證響應(yīng)曲面擬合結(jié)果的可靠性。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

2 結(jié)果與討論

2.1 HA標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制結(jié)果

在198 nm下測得HA標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1，吸光度與濃度之間的回歸方程為:y=7.805 0x+0.080 8(R2=0.998 3)，回歸方程線性顯著，該方程的有效線性范圍為0～0.25 mg/mL。

圖1 HA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 HA standard curve

2.2 HA純化結(jié)果與分析

由表2可知，提取后HA的含量為58.45%，純化后HA的含量為82.58%，提高了24.13%，純化后HA的分子質(zhì)量為22671.88。

表2 HA提取純化結(jié)果表Tables 2 The extraction and purification results of HA

2.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制結(jié)果

在420 nm下測得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2，吸光度與濃度之間的回歸方程為:y=0.013 3x-0.002 2(R2=0.992 6)，回歸方程線性顯著，該方程的有效線性范圍為0～10mg/mL。采用糖還原法測定產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量，降解前 HA相對分子質(zhì)量為22 671.88。

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Glucose standard curve

2.4 降解HA單因素的選擇結(jié)果分析

2.4.1 料液比單因素的選擇結(jié)果分析

由圖3可知，隨著比例的增加，產(chǎn)物的吸光度值達(dá)到最低點(diǎn)后有所回升，最后趨于平行，當(dāng)H2O2和VC添加量不一樣時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)生的自由基的量也會不同。H2O2和VC對降解都有一定影響，但經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，當(dāng)和VC添加量比H2O2多時(shí)得到的吸光度值低于H2O2比VC多時(shí)的吸光度值，因此，VC對降解影響不顯著，而H2O2的量對降解的影響相對較大。因此，單因素試驗(yàn)確定出最佳降解的料液比為4∶1。

圖3 料液比對HA降解的影響Fig.3 Influence of ratio of Solid-liquid on the degradation of HA

2.4.2 pH值單因素的選擇結(jié)果分析

以上研究結(jié)果多通過頂板結(jié)構(gòu)計(jì)算頂板來壓時(shí)的頂板壓力，從而確定支架合理工作阻力，但其計(jì)算過程復(fù)雜，需要參數(shù)眾多，具體實(shí)踐過程中，很多參數(shù)難以精確取得。筆者以酸刺溝煤礦6上105-2綜放工作面壓架事故為背景，通過現(xiàn)場實(shí)測和理論分析，對壓架機(jī)理進(jìn)行研究，同時(shí)對工作面實(shí)測礦壓數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，基于位態(tài)方程，從頂板控制效果出發(fā)，研究確定支架的合理工作阻力。

由圖4可知，隨著pH值的改變，透明質(zhì)酸降解程度不同，原因是pH會影響羥基自由基的產(chǎn)生，羥基自由基對HA的降解密切相關(guān)，在pH 8.0時(shí)HA降解程度達(dá)到最好。因此，由單因素試驗(yàn)可確定最佳降解pH值為8.0。

圖4 pH值對HA降解的影響Fig.4 Influence of pH on the degradation of HA

2.4.3 降解時(shí)間單因素的選擇結(jié)果分析

降解HA主要是靠降解體系內(nèi)自由基的作用，雖然自由基的作用很強(qiáng)但壽命極短。所以在反應(yīng)初期分子質(zhì)量下降很快，隨后逐漸趨于下降并趨于穩(wěn)定。由圖5可知，時(shí)間越長HA降解的程度降低。在時(shí)間5 min時(shí)HA降解程度達(dá)到最好，若繼續(xù)延長時(shí)間，HA降解的分子質(zhì)量呈上升趨勢。是因?yàn)榻到鈺r(shí)間過長可能使HA成分生物活性受到破壞，有效成分不再被降解，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)誤差增大。因此，降解時(shí)間確定為5min。

圖5 降解時(shí)間對HA降解的影響Fig.5 Influence of time on the degradation of HA

2.4.4 H2O2濃度單因素的選擇結(jié)果分析

H2O2的濃度對降解的影響很大，研究中自由基的量通過H2O2的量來表示，當(dāng)?shù)孜餄舛纫欢〞r(shí)，隨著自由基量的增加，分子量下降，當(dāng)下降到一定程度后，分量下降十分緩慢了。由圖6可知，隨著H2O2的濃度的改變，HA降解程度不同，在H2O2濃度為1.6 mol/L時(shí)HA降解程度達(dá)到最好。因此，確定最佳降解1.6 mol/L。

圖6 H2O2濃度對HA降解的影響Fig.6 Influence of H2O2concentration on the degradation of HA

2.5 響應(yīng)曲面法優(yōu)化HA的降解條件結(jié)果分析

2.5.1 多元回歸分析設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果分析

采用多元回歸分析，擬合二次多項(xiàng)式回歸模型的Box-Behnken設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見表3。利用 Design Expert軟件對表3數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得化學(xué)法降解雞冠中提取的HA對降解料液比(x1)、H2O2濃度(x2)和pH(x3)的二次多項(xiàng)回歸模型方程為:

Y=2 017.2-460.87x2-806.00x2-177.88x3-108.55x1x2-20.25x1x3-84.5x2x3+1 955.27X12+1 189.02X22+1 345.28X32

其中:Y，相對分子質(zhì)量;x1，料液比;x2，H2O2濃度mol/L;x3，pH。

從方程的方差分析表4可見，試驗(yàn)所選用的模型高度顯著(P＜0.000 1)，模型的校正決定系數(shù)0.978 4，說明該模型能解釋97.84%響應(yīng)值的變化，僅有總變異大約2.16%不能用此模型來解釋;相關(guān)系數(shù)R=0.990 6，說明該模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，該模型是合適的，可以用此來分析化學(xué)降解法對HA的降解程度。從表5的回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，模型一次項(xiàng)x1顯著、x2極顯著、x3不顯著;二次項(xiàng)x12(P ＜0.000 1)、x22(P ＜0.000 1)、x32(P＜0.000 1)極顯著;交互項(xiàng) x1x2，x2x3、x1x3不顯著。

表3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Experimental design and results

表4 響應(yīng)面模型方差分析表Table 4 Response surface model analysis of variance table

表5 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 5 Significance test of the regression equation coefficients

2.5.2 多元回歸方程的響應(yīng)曲面及其等高線圖解結(jié)果與分析

由圖7可知，料液比和H2O2濃度對降解HA的交互影響效應(yīng)。從其響應(yīng)曲面圖可以直觀的看出兩因素的交互作用不顯著，隨著料液比的增大，HA的降解程度逐漸提高，料液比和H2O2濃度均對降解均有影響，H2O2濃度高比例大降解程度最好，分子量最低點(diǎn)為料液比為4.13∶1，H2O2濃度為1.67 mol/L。

圖7 料液比、H2O2濃度及其交互作用對降解HA的響應(yīng)曲面圖Fig.7 Influence of liquid ratio，H2O2 concentration and their interactions on the response surface of the degradation of HA

由圖8可知，降解pH和料液比對降解雞冠中透明質(zhì)酸的交互影響效應(yīng)。從其響應(yīng)曲面圖可以看出兩因素的交互作用不顯著，在實(shí)驗(yàn)水平范圍內(nèi)，pH值對透明質(zhì)酸降解影響不明顯，相比料液比的作用更強(qiáng)，兩因素交互作用最低點(diǎn)為pH值為8.16，料液比為4.13∶1。

圖8 料液比、pH值及其交互作用對降解HA的響應(yīng)曲面Fig.8 Influence of liquid ratio，pH and their Interactions on the response surface of the degradation of HA

由圖9可知，pH與H2O2濃度對降解HA的交互影響效應(yīng)。從其響應(yīng)曲面圖可以直觀的看出兩因素的交互作用不顯著，在試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，H2O2濃度對HA的降解影響大，pH影響程度較小，兩項(xiàng)交互作用條件pH為8.16，H2O2濃度為1.67 mol/L時(shí)分子量達(dá)到最低點(diǎn)。

圖9 H2O2濃度、pH值及其交互作用對降解HA的響應(yīng)曲面Fig.9 Influence of H2O2concentration，pH and their Interactions on the response surface of the degradation of HA

2.5.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與分析

通過單因素及響應(yīng)曲面的分析，確定出降解HA最佳工藝條件。料液比為4.13∶1，pH為8.16，，降解時(shí)間為5 min;H2O2濃度為1.67 mol/L。根據(jù)確定的最佳降解條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，其結(jié)果見表6。

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表Table 6 The results of Verification test

采用優(yōu)化后的工藝降解HA，得出該工藝降解透明質(zhì)酸的分子量為1 764.67。

3 結(jié)論

從新鮮雞冠中提取的粗提物中HA含量為58.45%，經(jīng)純化后 HA的含量為82.12%，提高了24.13%，經(jīng)提取純化后得到的HA的相對分子質(zhì)量為2 2671.88，通過響應(yīng)曲面法對HA的降解條件進(jìn)行優(yōu)化，最佳條件為:料液比為4.13∶1，pH 8.16，H2O2濃度為1.67 mol/L。采用優(yōu)化后的條件降解HA，得出最佳降解條件下降解HA的分質(zhì)子量為1 764.67。

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