方芳，趙華，咸漠，劉輝

1(天津科技大學生物工程學院，天津，300457)

2(中國科學院生物基材料重點實驗室，中國科學院青島生物能源與過程研究所，山東青島，266101)

酵母菌是人類利用最早的微生物，廣泛應用于食品、醫(yī)藥和生命科學等領域。近年來，隨著數(shù)十種酵母基因組測序的完成，蛋白質(zhì)組學研究成為酵母生物學機制研究的熱點。雙向電泳技術(2-DE)是蛋白質(zhì)組學研究中的重要技術，樣品制備是雙向電泳的關鍵步驟。在樣品制備過程中，細胞破碎效果、裂解液中的蛋白溶解度、蛋白的修飾和降解等因素將直接影響到2-DE的準確度和重復性［1］。由于蛋白質(zhì)樣本的類型和來源、所處的狀態(tài)以及實驗目的和要求各不相同，目前并沒有一個通用的制備方法。要實現(xiàn)對低豐度蛋白的檢測，盡可能完全地破碎細胞，高效地溶解蛋白，避免低豐度蛋白的大量損失是至關重要的。如果所采用的制備方法的蛋白釋放率低，那么低豐度蛋白的損失會比較大，從而影響到低豐度蛋白在2-DE電泳中的分辨率以及檢測鑒定。

文獻報道的釀酒酵母2-DE樣品制備方法很多，如玻璃珠機械破碎、超聲破碎、表面活性劑處理、高壓破碎、酶法、沉淀法等，但是總體上蛋白釋放率在5%左右甚至更低［2-4］，遠低于酵母細胞的蛋白含量，蛋白圖譜中35 kDa以下的低豐度蛋白數(shù)量少、總的蛋白點個數(shù)也不多并且低豐度蛋白的分辨率很低。因此現(xiàn)有方法還無法完全滿足對低豐度蛋白檢測的需求。同時雖然有少數(shù)關于酵母細胞破碎方法比較的報導，如超聲破碎、玻璃珠破碎以及二者相結(jié)合的方法［5］，超聲破碎、超聲結(jié)合表面活性劑處理［6］等，但是還缺乏對樣品制備方法的綜合比較和分析?？紤]到釀酒酵母細胞壁機械強度大，破壁和胞內(nèi)蛋白提取困難的特點，為了提高蛋白溶解度以及低豐度蛋白在雙向電泳圖中的分辨率，本文以蛋白濃度和蛋白釋放率為指標，綜合考慮操作的簡便性等因素，比較了制備釀酒酵母全蛋白的常用方法，初步確定了玻璃珠方法為較理想的制備方法，在此方法的基礎上，對重要的操作參數(shù)(如破碎次數(shù)、玻璃珠用量、裝液比)通過單因素和正交試驗進行了優(yōu)化，并通過2-DE驗證，得出了蛋白點全面、溶解度高、低豐度蛋白清晰、適用于蛋白質(zhì)2-DE分析的釀酒酵母菌全蛋白制備方法。

1 材料與方法

1.1 原料

釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae YB332)，基因型:MATa NMT1 ura3 his3A200 ade2 lys2-801 leu2 FAA1 FAA2 FAA3 FAA4，來源:華盛頓大學藥學院分子生物學和藥理學實驗室。

1.2 培養(yǎng)基

YPD液體培養(yǎng)基:酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%。

1.3 主要材料與試劑

玻璃珠:Sigma-G9268。

雙向電泳膠條:GE Healthcare ImmobilineTMDryS-trip(pH=4 ～7，24 cm)。

裂解液:8 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4%(w/v)CHAPS，1%(w/v)DTT，0.8% 兩性電解質(zhì) pH 3 ～11，1 mmol/L PMSF，35 mmol/L Tris，5 mmol/L EDTA，DTT、兩性電解質(zhì)臨用前再加。

SDS-Tris HCl 緩沖液:0.1 mol/L Tris-HCl，pH 7.0，1.0%(w/v)SDS，1 mmol/L PMSF。

1.4 儀器設備

IS-RDS3恒溫振蕩器，Crystal Incubator Shaker;IS-RDS3恒溫振蕩器，上海福瑪;Cary 50-UV-Vis紫外分光光度儀，Varian;Vortex-Genie-2渦旋振蕩儀;E1061高壓破碎儀，Constant Systems LTD;VCX130超聲破碎儀，Sonics;Ettan雙向電泳系統(tǒng)(Ettan IPG-phor3，Ettan DALT six)GE Healthcare。

1.5 酵母培養(yǎng)

酵母細胞接種于5 mL YPD液體培養(yǎng)基進行種子培養(yǎng)，220 r/min，30℃培養(yǎng)20 h。取1 mL菌液轉(zhuǎn)接到100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，220 r/min，30℃培養(yǎng)27 h左右，OD600=1.2左右，低溫離心收集菌體。

1.6 全蛋白制備方法

1.6.1 方法 1

參照Curto等［2］的方法并做適當修改。取50 mg干重的菌體沉淀，用 10 mL Tris-HCl(pH 8.8，50 mmol/L)清洗菌體，6 000 r/min離心10 min，棄上清液，重復2次，向上述離心管中加入0.6g酸洗玻璃珠，1 mL裂解液于旋渦振蕩儀上振蕩30 s，冰浴30 s，重復60次，4℃，13 000r/min離心10 min收集上清液，待測蛋白濃度。

1.6.2 方法 2

參考Sudar等［5］超聲破碎的參數(shù)并做適當修改，將待破碎溶液放在含有冰水混合物的燒杯中進行超聲破碎，超聲條件為60 W，20 kHz，工作3 s，冰浴3 s，工作30 min，超聲完后4℃離心收集上清液。

1.6.3 方法 3

按方法1向菌體與裂解液混合物中加入玻璃珠，然后按方法2操作條件進行破碎［2，5］。

1.6.4 方法 4

參考Kolkman等［7］操作條件并做適當修改，用0.35 g酸洗玻璃珠破碎65 mg菌體沉淀，破碎60 s，冰浴30 s，6 次，加入650 μL 95 ℃ SDS-Tris HCl緩沖液，將樣品煮沸10 min，在冰上冷卻后，加入2 mL裂解液在冰中振蕩1 h，6 000 r/min離心10 min，收集上清液。

1.6.5 方法 5

按照Harder等［6］報道的方法，向50 mg干重的樣品中加入95℃ SDS-Tris HCl緩沖液超聲60 W，20 kHz，超聲3次，每次1 s，之后將樣品煮沸5 min后加入2 mL裂解液冰浴冷卻，在冰盒中振蕩1 h，6 000 r/min離心10 min，收集上清液。

1.6.6 方法六

的方法并做適當修改，2 mL裂解液懸浮50 mg菌體沉淀，使用Constant Systems LTD高壓破碎儀在20KPSI條件下破碎上述菌懸液，破碎3次，離心收集上清液［8］。

1.7 蛋白濃度測定

采用Bradford方法在紫外分光光度儀中測定595 nm處的吸光值來檢測蛋白濃度。

1.8 蛋白釋放率的測定

蛋白釋放率的測定可以通過測量上清液中可溶性蛋白的含量來確定細胞破碎的程度。蛋白釋放率:

1.9 雙向電泳

操作步驟參考文獻［9］。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白制備方法的比較

按照文獻報道的方法，進行釀酒酵母全蛋白制備，結(jié)果見表1。由表1可知，方法1蛋白濃度和蛋白釋放率比較理想，分別是 0.92±0.01 g/L 和6.31% ±0.05%，該方法采用玻璃珠破碎，操作簡便，樣品間不會交叉污染，不需要高壓設備，不添加SDS等試劑，低溫提取過程也有利于蛋白充分溶解［10-13］。方法2采用超聲破碎，蛋白釋放率最低，為5.57% ±0.11%，與 Iida 等［14］報道的蛋白釋放率(4.67% ±0.14%)接近。雖然有超聲破碎酵母的報道［15］，但是由于酵母細胞壁厚，單純超聲破碎酵母細胞的方法總體效率都不高。方法3采用超聲和玻璃珠相結(jié)合的破碎方法，雖然在超聲過程中添加玻璃珠能夠提高超聲的空化作用，但結(jié)果表明，其蛋白提取效果與方法1相比較并沒有顯著性差異，從操作簡便性考慮，方法1優(yōu)于方法3。方法4采用玻璃珠和表面活性劑SDS以及高溫處理酵母細胞，蛋白釋放率為5.85%±0.04%，蛋白濃度為0.78 ±0.03 g/L。該方法操作簡便，有利于大量樣品的處理，但是操作過程需要將樣品煮沸，可能造成蛋白的損失，不利于提高蛋白的釋放率和終濃度。另外該方法采用了SDS陰離子去污劑，其缺點是能與蛋白質(zhì)形成帶負電的復合物，可能會影響到2-DE等電聚焦過程。方法5采用超聲結(jié)合表面活性劑SDS和高溫處理酵母細胞，其效果與方法四接近。方法6采用高壓細胞破碎儀破碎酵母，蛋白濃度和蛋白釋放率分別為0.83±0.05 g/L和5.96% ±0.08%，該方法非常簡便，易于操作。

通過比較蛋白濃度和蛋白釋放率，并綜合考慮操作的簡便性等特點，方法1的蛋白制備效果較好，但是其蛋白濃度和蛋白釋放率還需要優(yōu)化，因此在此基礎上考察了破碎次數(shù)、裝液比、玻璃珠用量對蛋白制備效果的影響。

2.2 破碎次數(shù)對蛋白提取的影響

破碎次數(shù)與菌體破碎程度、蛋白釋放率和終濃度密切相關。本文在裝液比50%，玻璃珠0.6 g，破碎30 s，冰浴30 s的條件下，考察了破碎次數(shù)30、45、60、75、90次對釀酒酵母蛋白提取的影響。由圖1(a)可知，破碎60次，釀酒酵母的蛋白釋放率和蛋白濃度都達到了最大值，反而隨著破碎次數(shù)的增加，蛋白釋放率和蛋白濃度下降很快，原因可能是隨著破碎次數(shù)的增加延長了操作時間，致使蛋白酶抑制劑失活，部分蛋白被降解。

2.3 玻璃珠用量對蛋白提取的影響

玻璃珠的用量也是影響蛋白提取的重要參數(shù)。本文在破碎次數(shù)60次，裝液比為50%，菌體干重為50 mg條件下，考察玻璃珠用量對蛋白釋放率和蛋白濃度的影響。由圖1(b)可知，玻璃珠在0.3～1.0 g的變化范圍內(nèi)，蛋白釋放率和濃度都是逐漸上升的，但是，玻璃珠質(zhì)量大于1.0 g時，蛋白釋放率和濃度都不再增加，得到了玻璃珠最佳用量為1.0 g。

2.4 裝液比對蛋白提取的影響

裝液比(即裂解液、玻璃珠和菌體的總體積與離心管容積的比例)會影響玻璃珠的轉(zhuǎn)速以及剪切力的大小，從而影響破碎效果。因此本文在破碎60次，玻璃珠1.0 g條件下，考察了裝液比20%、40%、50%對蛋白制備的影響。從圖1(c)可知，蛋白釋放率和蛋白濃度都隨著裝液比的降低而升高，考慮到實際可操作性，本實驗沒有繼續(xù)降低裝液比，選擇20%為最適裝液比。

圖1 不同變量對蛋白濃度和蛋白釋放率的影響Fig.1 Effects of variables on the concentration and yield of protein

2.5 玻璃珠破碎條件的正交試驗優(yōu)化

在單因素實驗的基礎上，以破碎次數(shù)、玻璃珠用量、裝液比為因素，采用L9(33)正交表分別以蛋白濃度、蛋白釋放率和基于以上兩個指標的歸一化處理為指標進行優(yōu)化設計，因素水平見表2，結(jié)果見表3。

表2 因素水平設計Table 2 The factors and levels in design

表3 正交試驗設計與結(jié)果Table 3 The orthogonal experimental design and results

由表3可知，3個因素對蛋白濃度的影響從大到小依次是破碎次數(shù)、裝液比、玻璃珠用量，最優(yōu)組合是A2B2C3。影響蛋白釋放率的因素大小依次為破碎次數(shù)、玻璃珠用量、裝液比，最優(yōu)組合是A2B3C3。采用了歸一化處理，綜合評價兩個指標，對玻璃珠破碎效果影響因素從大到小依次為破碎次數(shù)、裝液比、玻璃珠用量，最優(yōu)條件是 A2B2C3，即破碎60次，玻璃珠1.0 g，裝液比20%。采用此最優(yōu)條件破碎50 mg干重的酵母菌體菌體，測定其蛋白濃度和蛋白釋放率分別是1.21g/L和9.23%，均高于正交試驗中的各組試驗。

2.6 最優(yōu)蛋白制備方法的驗證

本文分別采用優(yōu)化前后的制備方法獲得蛋白樣品，并通過蛋白質(zhì)雙向電泳進行了驗證，結(jié)果如圖2(1)、(2)所示。由圖2可知，優(yōu)化后的電泳圖像蛋白點清晰，優(yōu)化前后的電泳圖像中蛋白點個數(shù)有明顯的變化，從124個蛋白增加到181個蛋白;35 kDa以下的低豐度蛋白明顯增加，由原來的26個蛋白點增加到53個，提高了1倍;(35～100)kDa大小的低豐度蛋白比優(yōu)化前的分辨率高，有利于結(jié)果的分析和質(zhì)譜鑒定。此外，采用優(yōu)化后的方法，雙向電泳結(jié)果平行性好，可重復，說明該制備方法可以很好的滿足釀酒酵母蛋白質(zhì)組學研究要求。

圖2 電泳圖像Fig.2 Electrophoresis images

3 結(jié)論

為了提高雙向電泳樣品蛋白質(zhì)的溶解度，抽提最大量的總蛋白，減少蛋白質(zhì)的損失，找到適合釀酒酵母雙向電泳樣品制備的方法，本文按照文獻報道，比較了6種釀酒酵母全蛋白制備的方法，并選擇方法1對其進行正交試驗優(yōu)化，得到的最佳條件為:50 mg干重的釀酒酵母菌體，1 mL裂解液，玻璃珠1 g，裝液比20%，渦旋振蕩30 s，冰浴30 s，重復以上操作60次，蛋白釋放率達到了9.23%，蛋白濃度1.21 g/L，均比較理想，采用該方法提取的全蛋白，進行雙向電泳驗證，得到了蛋白點清晰、低豐度蛋白分辨率高的圖像，并且雙向電泳圖像具備平行性，重復性好，說明該蛋白制備方法可以很好的用于蛋白質(zhì)組學研究。

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