孫小梅，戴軍，陳尚衛(wèi)，朱松

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫，214122)

靈芝在我國(guó)作為傳統(tǒng)的藥食兩用真菌已有2 000多年歷史，是中華醫(yī)藥學(xué)寶庫(kù)中的珍品。國(guó)內(nèi)外諸多研究表明，靈芝的藥理活性歸因于其含有的多糖、三萜類、腺苷類、生物堿、甾醇和氨基酸等，它們?cè)陟`芝的藥用保健功能中發(fā)揮著很重要的作用［1］。許多文獻(xiàn)報(bào)道靈芝多糖具有調(diào)節(jié)免疫［2-5］、抗腫瘤［6-7］、抗氧化［8-9］、抗肝炎［10］以及抗糖尿病［11］等生物活性，被認(rèn)為是靈芝中活性最大、效用最高的成分。

我國(guó)分布有大量的不同種類靈芝，而同一個(gè)靈芝品種在不同的環(huán)境中生長(zhǎng)，其子實(shí)體的營(yíng)養(yǎng)成分含量，組成及結(jié)構(gòu)等也會(huì)有較大的差異［12-15］。而不同來(lái)源的靈芝的多糖分子質(zhì)量分布、糖組成及結(jié)構(gòu)不同，其生物活性也不相同。據(jù)報(bào)道，靈芝多糖分子質(zhì)量大于1×104時(shí)，顯示強(qiáng)抑制腫瘤活性［10］。而不同提取方法提取得到的靈芝多糖，其分子質(zhì)量分布和結(jié)構(gòu)不盡相同，活性也有差異?；钚詮?qiáng)弱與其相對(duì)分子質(zhì)量、溶解度、多糖鏈的分支程度及支鏈上羥基取代的數(shù)量、糖苷鍵的類型、以及多糖的立體構(gòu)型等有關(guān)［16］?，F(xiàn)今，市場(chǎng)上各類靈芝類保健品越來(lái)越多，人們對(duì)其保健功效質(zhì)量?jī)?yōu)劣的要求也越來(lái)越高，對(duì)靈芝以及靈芝產(chǎn)品的質(zhì)量檢測(cè)與控制也尤為重要。為了建立快速有效且可靠的分析檢測(cè)方法，以及避免在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中靈芝多糖的生物活性受到影響，選擇合適的多糖提取方法也十分重要。本研究擬采用4種提取方法提取靈芝子實(shí)體多糖，通過(guò)比較多糖得率以及所得多糖的分子質(zhì)量分布來(lái)選擇最優(yōu)提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 樣品與試劑

乙醇(分析純);超純水;濃H2SO4(分析純);苯酚;NaNO3(分析純);葡萄糖對(duì)照品;Dextran系列葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品;11個(gè)赤芝子實(shí)體樣品，分別收集自山東、福建、浙江、遼寧等地區(qū)。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Waters 600高效液相色譜儀，配置Waters 600四元泵，2410示差折光檢測(cè)器，7725i進(jìn)樣閥，Empower 2色譜工作站;721N型可見光分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;CEM-MARS5型微波消解系統(tǒng)，美國(guó)CEM公司;ASE100加速溶劑萃取儀，美國(guó)DIONEX中國(guó)有限公司;5415D小型高速離心機(jī);QT-1漩渦混合器，上海琪特分析儀器有限公司;RE52-2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海滬西分析儀器廠;SHZ-3循環(huán)水多用真空泵，上海滬西分析儀器廠;HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠;Avanti J-E多用高效冷凍離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 靈芝多糖的提取

將收集的不同的靈芝子實(shí)體樣品置真空干燥箱中35℃烘干，切片粉碎。準(zhǔn)確稱取靈芝子實(shí)體樣品約5.00 g，加純水浸泡過(guò)夜，再分別在超聲波、微波、加速加壓或者回流等輔助條件下提取，經(jīng)濃縮、醇沉、離心、洗滌、離心、干燥等，得粗多糖水溶液。

1.2.2 多糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

多糖得率/%=［提取液中多糖含量(g)/靈芝粉樣品質(zhì)量(g)］×100

1.2.3 高效體積排阻色譜法分析多糖分子量分布

(1)色譜條件。色譜柱:Waters UltrahydrogelTM Linear 2根串聯(lián)(7.8 mm×300 mm);檢測(cè)器:示差折光檢測(cè)器(RID);流動(dòng)相:0.1 mol/L NaNO3;流速:0.6 mL/min;柱溫:45℃。

(2)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線。將不同分子質(zhì)量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品配置成約3 mg/mL的溶液，進(jìn)樣分析。根據(jù)每個(gè)標(biāo)樣的保留時(shí)間和對(duì)應(yīng)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值，由GPC軟件自動(dòng)作出分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(3)樣品分子質(zhì)量分布分析。對(duì)上述1.2.1中提取得到的多糖溶液，分別進(jìn)樣分析。根據(jù)上述得到的分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線，由GPC軟件自動(dòng)計(jì)算出每個(gè)樣品的色譜圖中各個(gè)峰的相對(duì)分子質(zhì)量。

2 結(jié)果分析

2.1 不同提取方法多糖提取率比較

2.1.1 超聲波輔助提取

單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化超聲波輔助提取時(shí)間、溫度以及料液比等對(duì)靈芝多糖提取的影響，結(jié)果見圖1。超聲功率額定為250 W，圖1-a顯示隨著提取溫度升高，多糖得率不斷增大。圖1-b表明超聲時(shí)間越長(zhǎng)，多糖得率越高，60 min時(shí)得率最大，之后有下降趨勢(shì)，可能是由于長(zhǎng)時(shí)間超聲作用使多糖降解，得率反而下降。圖1-c顯示料液比對(duì)多糖得率的影響相對(duì)不大，隨著提取溶劑比例增加，得率也變大，但變化幅度較小。

圖1 超聲輔助提取靈芝子實(shí)體多糖單因素實(shí)驗(yàn)Fig.1 Single factor experiments of ultrasonic-assisted extraction method

在以上單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化最佳提取條件，正交試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 超聲輔助提取正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of ultrasonic-assisted extraction orthogonal tests

比較超聲時(shí)間、溫度以及料液比3個(gè)因素的極差R:R(超聲溫度)＞R(超聲時(shí)間)＞R(料液比)，可見超聲溫度是關(guān)鍵的影響因素。超聲波輔助提取的最優(yōu)條件為:料液比 1∶20，70 ℃，50 min，提取率為0.610%。在選擇的最佳條件下，進(jìn)行3次重復(fù)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所得的多糖得率分別為0.634%、0.621%、0.617%，說(shuō)明選擇的超聲輔助提取條件基本穩(wěn)定。

2.1.2 微波輔助提取

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。微波溫度對(duì)多糖得率的影響明顯，溫度升高，多糖得率也增大;隨著微波時(shí)間增加，多糖不斷被提取出來(lái)，但得率增長(zhǎng)幅度不大，可能是因?yàn)榇蠓肿淤|(zhì)量的多糖不能被提取出來(lái)，也可能是因?yàn)槲⒉芷茐亩嗵墙Y(jié)構(gòu)，使多糖得率較小。同樣，提取溶劑比例增大，多糖得率也逐漸變大。

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見表2。表2極差分析結(jié)果顯示:R(提取溫度)＞R(料液比)＞R(提取時(shí)間)，發(fā)現(xiàn)溫度的影響最為顯著。由正交試驗(yàn)結(jié)果選擇最優(yōu)的提取條件為:料液比1∶25，提取溫度110℃，提取時(shí)間20 min，得率為0.515%。同時(shí)在此條件下，進(jìn)行3次重復(fù)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，多糖得率分別為0.534%、0.512%、0.522%，表明所選擇的微波輔助提取條件基本穩(wěn)定。

圖2 微波輔助提取靈芝子實(shí)體多糖單因素實(shí)驗(yàn)Fig.2 Single factor experiments of microwave-assisted extraction method

表2 微波輔助提取正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of microwave-assisted extraction orthogonal tests

2.1.3 加速溶劑萃取

分別考察萃取時(shí)間和溫度對(duì)子實(shí)體多糖的得率的影響，結(jié)果見圖3。隨著萃取溫度升高，多糖得率不斷升高，在考察的水平范圍內(nèi)，多糖得率沒有出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，但不能肯定溫度繼續(xù)升高是否對(duì)多糖提取有負(fù)影響。故選擇提取溫度為130℃。靜態(tài)提取時(shí)間也對(duì)多糖的提取有影響，在5～15 min多糖得率持續(xù)升高，但提取時(shí)間增加到20 min時(shí)，有稍許下降，可能是由于多糖被破壞降解，也可能是存在實(shí)驗(yàn)誤差。故選擇靜態(tài)提取時(shí)間為15 min。

由于儀器條件限制，且此萃取方法所需溶劑(純水)用量少，不好控制，故未能對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化。故選用較優(yōu)的提取條件為萃取溫度130℃，靜置15 min，提取2次，提取率為0.654%。

2.1.4 水浴回流提取

圖3 加速溶劑萃取靈芝子實(shí)體多糖單因素實(shí)驗(yàn)Fig.3 Single factor experiments of accelerated solvent extraction

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，圖4-a顯示水浴溫度與多糖得率呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，溫度達(dá)到90℃時(shí)，多糖得率增大明顯，而繼續(xù)升到100℃時(shí)，得率仍有增加。圖4-b表明提取時(shí)間延長(zhǎng)，多糖得率也不斷增加。由圖4-c可知料液比對(duì)多糖得率的影響較小，隨著提取溶劑比例增加，多糖溶出有增加但是增加的幅度較小。

在上述單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化最佳條件，結(jié)果見表3。分析結(jié)果顯示:R(水浴溫度)＞R(水浴時(shí)間)＞R(料液比)，表明溫度是較關(guān)鍵的影響因素。故選擇正交試驗(yàn)中最優(yōu)的提取條件為:料液比1∶20，100℃，6 h，多糖提取率為 0.671%。并在此條件下，進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示多糖得率分別為0.664%、0.678%、0.683%，說(shuō)明選擇的 水浴回流提取提取條件基本穩(wěn)定。

圖4 水浴回流提取靈芝子實(shí)體多糖單因素實(shí)驗(yàn)Fig.4 Single factor experiments of heating reflux extraction method

表3 水浴回流提取正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of heating reflux extraction orthogonal test

以上結(jié)果表明，多糖得率大小:水浴回流提?。炯铀偃軇┹腿。境暡ㄝo助提?。疚⒉ㄝo助提取。由此可見，水浴回流提取和加速溶劑萃取的多糖得率較高，前者溫度高，能耗高，時(shí)間長(zhǎng)，后者在高溫高壓條件下快速萃取多糖，效率高，條件溫和。而超聲波和微波的能量高，能破壞細(xì)胞壁使多糖溶出，但同時(shí)也可能會(huì)使得溶出的多糖被降解，在醇沉?xí)r被棄去，從而使得測(cè)定的多糖得率低。但比較而言，超聲波輔助提取的多糖得率相對(duì)較高，方法也更簡(jiǎn)便實(shí)際。

2.2 不同提取方法多糖分子量分布比較

用高效體積排阻色譜法對(duì)4種方法最佳提取條件下提取得到的靈芝子實(shí)體多糖進(jìn)行分子質(zhì)量分布分析，其分子質(zhì)量分布的情況如圖5所示。

圖5 四種不同的提取方法得到多糖的分子質(zhì)量分布Fig.5 Molecular weight distribution of G.lucidum fruiting bodies polysaccharides extracted with four different extraction methods

表4顯示水浴回流提取、加速溶劑萃取以及超聲波輔助提取所得的多糖分子量大于10 kDa級(jí)分含量相差不大，分別是50.50%、51.92%及49.17%(圖5中1、2、3號(hào)圖譜)，表明3種提取方法對(duì)多糖結(jié)構(gòu)的破壞均不大。而微波輔助法提取的多糖分子量大于10 kDa的級(jí)分含量相對(duì)較低(圖5中4號(hào)圖譜)，可能是因?yàn)槲⒉▽?duì)多糖結(jié)構(gòu)的破壞作用相對(duì)較大。加速溶劑萃取法的提取成本較高且普及率較低，超聲波輔助法與加速溶劑萃取法的提取效果差異較小，且具有更好的實(shí)際應(yīng)用性，故選用超聲波輔助法提取靈芝子實(shí)體多糖。

表4 不同提取方法提取的多糖分子質(zhì)量分布Table 4 Molecular weight distribution of polysaccharides under different extraction conditions

2.3 不同來(lái)源的赤芝子實(shí)體多糖的分子量分布比較

表5顯示了超聲波輔助提取的11個(gè)赤芝子實(shí)體多糖分子量分布情況。從表5可見，其中3個(gè)子實(shí)體樣品多糖分子質(zhì)量在100～1 000 kDa范圍的級(jí)分的相對(duì)含量較高，而其他子實(shí)體多糖分子質(zhì)量100～1 000 kDa的級(jí)分的相對(duì)含量卻很少甚至沒有。比較不同樣品的菌株，產(chǎn)地等，發(fā)現(xiàn)菌株、栽培方式及產(chǎn)地等對(duì)靈芝多糖的分子質(zhì)量分布都有影響。4號(hào)、5號(hào)和10號(hào)樣品分別是收集自不同地區(qū)的段木栽培的同種菌株的赤芝子實(shí)體(如圖6-a)。這3個(gè)樣品菌株來(lái)源相同，相同提取方法下得到的多糖的分子質(zhì)量分布相似。1號(hào)和2號(hào)子實(shí)體是相同地區(qū)不同批次的代料栽培的赤芝子實(shí)體，兩者分子質(zhì)量差異也很小，以分子質(zhì)量小于10 kDa的級(jí)分為主(如圖6-b);3、6、8、9和11號(hào)子實(shí)體是不同產(chǎn)地的相同菌株的段木栽培的赤芝子實(shí)體，以分子質(zhì)量在2～10 kDa以及10～100 kDa 2個(gè)級(jí)分為主，7號(hào)樣品的菌株與以上5種子實(shí)體不同，但多糖也以分子質(zhì)量在2～10 kDa和10～100 kDa 2個(gè)級(jí)分為主。由此可見，影響靈芝多糖分子質(zhì)量分布的因素較多，關(guān)系也較復(fù)雜，仍有待進(jìn)一步研究。

表5 超聲波輔助提取不同的赤芝子實(shí)體多糖分子量分布Table 5 Molecular weight distributions of different G.lucidum fruiting bodies polysaccharides under ultrasonic-assisted condition

圖65 號(hào)(a)和2號(hào)(b)赤芝子實(shí)體多糖的分子量分布Fig.6 Molecular weight distribution of polysaccharides of sample 5(a)and sample 2(b)

3 結(jié)論

比較了4種不同的赤芝子實(shí)體多糖提取方法，綜合考慮多糖得率以及提取所得多糖的分子質(zhì)量分布情況，同時(shí)結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用的情況，選擇超聲波輔助提取法，并確定最佳條件為超聲功率250 W，70℃，超聲50 min，料液比1∶20。此外，比較了超聲輔助法提取的不同來(lái)源的赤芝子實(shí)體的多糖分子質(zhì)量分布情況，發(fā)現(xiàn)不同菌株、不同栽培方式以及不同產(chǎn)地等都會(huì)對(duì)多糖分子量產(chǎn)生一定的影響。靈芝多糖的分子量分布作為可以簡(jiǎn)單直接評(píng)價(jià)靈芝質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，仍需要進(jìn)一步深入地研究。

［1］ 陳國(guó)良，陳曉清.靈芝有效成分研究綜述［J］.中國(guó)食用菌，1995，4(4):7-9.

［2］ BAO X F，WANG X S，DONG Q，et al.Structural fea-tures of immunologically active polysaccharides from Ganoderma lucidum［J］.Phytochemistry，2002，59:175-181.

［3］ CHEN W Y，YANG W B，WONG C H，et al.Effect of Reishi polysaccharides on human stem/progenitor cells［J］.Bioorganic＆ Medicinal Chemistry，2010，18(24):8 583-8 591.

［4］ HUANG S Q，NING Z X.Extraction of polysaccharide from Ganoderma lucidum and its immune enhancement activity［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2010，47(3):336-341.

［5］ LAI C Y，HUNG J T，LIN H H，et al.Immunomodulatory and adjuvant activities of a polysaccharide extract of Ganoderma lucidum in vivo and in vitro ［J］.Vaccine，2010，28:4 945-4 954.

［6］ ZHANG M，CUI S W，CHEUNG P C K，et al.Antitumor polysaccharides from mushrooms:A review on their isolation process，structural characteristics and antitumor activity［J］.Trends in Food Science ＆ Technology，2007，18(1):4-19.

［7］ 王冠英，張潔，王德友.松杉靈芝子實(shí)體抗腫瘤活性多糖的提取、分離與鑒定［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2011，3(31):838-839.

［8］ LIU W，WANG H Y，PANG X B，et al.Characterization and antioxidant activity of two low-molecular-weight polysaccharides purified from the fruiting bodies of Ganoderma lucidum［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2010，46:451-457.

［9］ YU R M，YANG W，SONG L Y，et al.Structural characterization and antioxidant activity of a polysaccharide from the fruiting bodies of cultured Cordyceps militaris［J］.Carbohydrate Polymers，2007，70:430-436.

［10］ LI Y Q，F(xiàn)ANG L，ZHANG K C.Structure and bioactivities of a galactose rich extracellular polysaccharide from submergedly cultured Ganoderma lucidum［J］.Carbohydrate Polymers，2007，68:323-328.

［11］ Seto S W，Lam T Y，Tam H L，et al.Novel hypoglycemic effects of Ganoderma lucidum water-extract in obese/diabetic(+db/+db)mice［J］.Phytomedicine，2009，16:426-436.

［12］ 林志彬.靈芝的現(xiàn)代研究［M］.北京:北京醫(yī)科大學(xué)出版社，2001:3-19.

［13］ 徐新春，徐鴻華，丁平，等.不同栽培因素對(duì)靈芝化學(xué)成分含量的影響［J］.時(shí)珍國(guó)藥研究，1997，8(5):465-467.

［14］ 徐凌川，許昌盛.18種不同來(lái)源靈芝的多糖含量測(cè)定［J］.世界科學(xué)技術(shù):中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2004，6(2):57-60.

［15］ 邢增濤，郁瓊花，張勁松，等.不同品種靈芝中三萜類化合物的比較研究［J］.中藥材，2004，27(8):575-576.

［16］ YE L B，ZHANG J S，YE X J，et al.Structural elucidation of the polysaccharide moiety of aglycopeptide(GLPCW-II)from Ganoderma lucidum fruiting bodies［J］.Carbohydrate Research，2008，343(4):746-752.