李輝，姚粟，劉洋，白飛榮，扎西·才吉，程池

1(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京，100015)

2(玉樹(shù)藏族自治州三江源藥業(yè)有限公司，青海玉樹(shù)，810003)

冬蟲(chóng)夏草(Ophicordyceps sinensis)是我國(guó)青藏高原地區(qū)的珍稀物種資源，富含蟲(chóng)草酸、蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草多糖、麥角甾醇等多種生物活性物質(zhì)，具有獨(dú)特的保健功能和特殊藥效［1］。不同來(lái)源的冬蟲(chóng)夏草由于受到當(dāng)?shù)赝寥?、氣候以及其他生長(zhǎng)環(huán)境因素的影響，在蟲(chóng)體的大小，飽滿度以及有效成分的含量上存在較大差異，因而經(jīng)濟(jì)價(jià)值也不同。目前，市場(chǎng)上產(chǎn)于青海玉樹(shù)、果洛，西藏那曲等地區(qū)的冬蟲(chóng)夏草由于蟲(chóng)體大而飽滿，價(jià)格要高于其他產(chǎn)地的蟲(chóng)草，一些不法商家為謀取高額利潤(rùn)，常常以其他產(chǎn)地蟲(chóng)草冒充玉樹(shù)、果洛或那曲蟲(chóng)草銷售，嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者利益，不利于冬蟲(chóng)夏草產(chǎn)業(yè)的健康有序發(fā)展。

目前，我國(guó)尚未建立穩(wěn)定有效的冬蟲(chóng)夏草的原產(chǎn)地鑒別技術(shù)方法。長(zhǎng)期以來(lái)，我國(guó)對(duì)冬蟲(chóng)夏草產(chǎn)地鑒別技術(shù)主要集中于冬蟲(chóng)夏草的形態(tài)學(xué)、理化指標(biāo)的分析和檢測(cè)方法等方面［2］，這類常規(guī)方法操作復(fù)雜，且檢測(cè)指標(biāo)尚不完善，在準(zhǔn)確性和高效性方面存在一定的局限性。近年來(lái)，一些研究者陸續(xù)將隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)［3］、簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性(ISSR)［4］等分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于冬蟲(chóng)夏草產(chǎn)地鑒別，但是同一個(gè)產(chǎn)地冬蟲(chóng)夏草樣品之間本身就存在著較大的遺傳差異(主要在于冬蟲(chóng)夏草寄生的蝙蝠蛾幼蟲(chóng)種類不同)，這類通過(guò)分子遺傳差異來(lái)鑒別冬蟲(chóng)夏草的技術(shù)很難產(chǎn)生重復(fù)性好，穩(wěn)定性高的結(jié)果。因此，建立一套快速、準(zhǔn)確的冬蟲(chóng)夏草原草原產(chǎn)地鑒別方法成為亟需解決的問(wèn)題。

穩(wěn)定同位素分析技術(shù)在過(guò)去30多年間，已在食品生產(chǎn)的某些領(lǐng)域，如葡萄酒、飲料、蜂蜜等［5-7］的產(chǎn)地鑒別中成功應(yīng)用，有些同位素方法已得到官方分析化學(xué)家協(xié)會(huì)(AOAC)及歐洲標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CEN)的認(rèn)可［8］。近年來(lái)，其在中藥材的地理來(lái)源溯源分析中也開(kāi)始有應(yīng)用的報(bào)道，如Micha Horacek等［9］利用C、N、H等穩(wěn)定同位素對(duì)來(lái)源于中國(guó)和韓國(guó)的人參展開(kāi)產(chǎn)地鑒別研究，對(duì)29種樣品進(jìn)行了準(zhǔn)確的產(chǎn)地鑒別，并認(rèn)為該技術(shù)是一種穩(wěn)定有效的產(chǎn)地鑒別技術(shù)。

本課題組在前人研究的基礎(chǔ)上，利用同位素比值質(zhì)譜儀對(duì)不同產(chǎn)區(qū)冬蟲(chóng)夏草樣品的N、C穩(wěn)定同位素進(jìn)行測(cè)定分析和比對(duì)研究，試圖建立一種快速有效的冬蟲(chóng)夏草穩(wěn)定同位素溯源技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 冬蟲(chóng)夏草樣品

本研究收集了來(lái)自我國(guó)青海省、四川省、云南省以及尼泊爾的12個(gè)不同產(chǎn)區(qū)冬蟲(chóng)夏草樣品，以及來(lái)自貴州省、江西省和湖南省的3種亞香棒蟲(chóng)草樣品。

1.1.2 主要儀器

Delta v Advantage穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀、Flash EA1112元素分析儀、ConfloⅢ稀釋儀，美國(guó) Thermo Scientific公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 冬蟲(chóng)夏草樣品的前處理

取冬蟲(chóng)夏草樣品一支，用去離子水浸泡清洗，在60℃恒溫干燥12 h，用V(三氯甲烷)∶V(甲醇)=2∶1混合液浸泡2 h進(jìn)行脫脂，用去離子水清洗、浸泡30 min，再用 V(三氯甲烷)∶V(甲醇)2∶1混合液浸泡。最后用去離子水清洗，60℃干燥后采用組織研磨儀研磨至粉末狀，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中保存。

1.2.2 穩(wěn)定同位素的測(cè)定

分別取1.0 mg和0.5 mg前處理后的樣品，用錫箔杯包好后通過(guò)自動(dòng)采樣器送到元素分析儀中，將樣品中的氮元素轉(zhuǎn)化成為N2和CO2氣體，再經(jīng)過(guò)稀釋儀，最后進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。具體參數(shù)如下:

元素分析儀:進(jìn)樣器氦氣吹掃流量為200 mL/min，氧化爐溫度為980℃，還原爐溫度為650℃，載氣氦氣流量為90 mL/min。稀釋儀:氦氣稀釋壓力為60 kPa，N2和CO2參考?xì)鈮毫鶠?0 kPa。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

同位素測(cè)定結(jié)果以 δ‰表示:δ‰ =(R樣品/R標(biāo)準(zhǔn)-1)×1 000，R代表樣品和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中重同位素與輕同位素的豐度比，δ13C的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為V-PDB，δ15N的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為空氣。

采用Origin8.0軟件對(duì)樣品的δ15N和δ13C數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得不同來(lái)源冬蟲(chóng)夏草和亞香棒蟲(chóng)草樣品的箱線圖，并采用雙樣品t檢驗(yàn)法，檢驗(yàn)來(lái)源于青海玉樹(shù)、果洛冬蟲(chóng)夏草樣品和其他地區(qū)冬蟲(chóng)夏草樣品的顯著性差異，以及冬蟲(chóng)夏草樣品和亞香棒蟲(chóng)草樣品的顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬蟲(chóng)夏草N穩(wěn)定同位素比值分析

12種不同來(lái)源冬蟲(chóng)夏草樣品和3種亞香棒蟲(chóng)草樣品的δ15N值測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。其中來(lái)源于青海樣品的δ15N值范圍為-0.220‰～2.195‰，來(lái)源云南樣品的δ15N值范圍為-0.965‰～-0.190‰，來(lái)源于四川樣品的δ15N值范圍為0.055‰～0.280‰，來(lái)源于尼泊爾樣品的δ15N值為-3.106‰，亞香棒蟲(chóng)草樣品的δ15N值范圍為-5.755‰～-3.160‰。

通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)冬蟲(chóng)夏草的δ15N值波動(dòng)范圍不同，除來(lái)源于青海海南州樣品(δ15N=-0.220‰)與云南省樣品δ15N值有重疊外，其他樣品均可按青海、四川、云南、尼泊爾等地理來(lái)源有效區(qū)分(圖1)，其中來(lái)源于玉樹(shù)和果洛的優(yōu)質(zhì)冬蟲(chóng)夏草樣品與其他來(lái)源冬蟲(chóng)夏草樣品的δ15N值波動(dòng)范圍明顯不同，雙樣品t檢驗(yàn)結(jié)果表明兩類樣品存在顯著差異(P＜0.009)(圖2);冬蟲(chóng)夏草樣品與亞香棒蟲(chóng)草樣品的δ15N值波動(dòng)范圍差異尤為明顯，雙樣品t檢驗(yàn)結(jié)果表明兩類樣品也存在顯著差異(P＜0.000 6)(圖3)。

圖1 不同來(lái)源樣品δ15N值的箱線圖Fig.2 Box plot of δ15N values from different samples

圖2 來(lái)源于玉樹(shù)和果洛的冬蟲(chóng)夏草樣品與其他來(lái)源冬蟲(chóng)夏草樣品的δ15N值箱線圖Fig.2 Box plot of δ15N values between samples from Yushu-Guoluo and other origins

圖3 冬蟲(chóng)夏草樣品與亞香棒蟲(chóng)草δ15N值的箱線圖Fig.3 Box plot of δ15N values between Ophicordyceps sinensis and Cordyceps hawkesii

2.2 冬蟲(chóng)夏草C穩(wěn)定同位素比值分析

12種不同來(lái)源冬蟲(chóng)夏草樣品和3種亞香棒蟲(chóng)草樣品的δ13C值測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。其中來(lái)源于青海樣品的δ13C值范圍為-27.90‰～-25.95‰，來(lái)源云南樣品的δ13C值范圍為-27.01‰～-26.10‰，來(lái)源于四川樣品的 δ13C值范圍為 -27.6‰ ～-26.64‰，來(lái)源于尼泊爾樣品的 δ13C值為-28.34‰，亞香棒蟲(chóng)草樣品的 δ13C值范圍為-28.23‰ ～ -27.42‰(表1)。

通過(guò)比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)冬蟲(chóng)夏草的δ13C值波動(dòng)范圍均較大重疊，無(wú)法有效區(qū)分，但冬蟲(chóng)夏草δ13C值(-27.90‰ ～-25.95‰)和亞香棒蟲(chóng)草(-28.23‰～-27.42‰)具有一定的差異(圖4)。

表1 冬蟲(chóng)夏草樣品及δ15N測(cè)定結(jié)果Table 1 Ophicordyceps sinensis samples and δ15N values

圖4 不同來(lái)源樣品的δ13C值箱線圖Fig.4 Box plot of δ13C values from different samples

3 討論

本研究利用同位素比值質(zhì)譜儀(IRMS)測(cè)定了來(lái)自我國(guó)青海、云南、四川以及尼泊爾的12個(gè)不同產(chǎn)區(qū)冬蟲(chóng)夏草以及來(lái)自貴州省、江西省和湖南省的3種亞香棒蟲(chóng)草的δ15N和δ13C值，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，不同地區(qū)冬蟲(chóng)夏草的δ15N值波動(dòng)范圍明顯不同，除來(lái)源于青海海南州的1個(gè)樣品外，其他樣品均可按青海、四川、云南、尼泊爾等地理來(lái)源有效區(qū)分;其中來(lái)源于青海玉樹(shù)、果洛的優(yōu)質(zhì)冬蟲(chóng)夏草樣品與其他產(chǎn)地冬蟲(chóng)夏草樣品存在顯著差異(P＜0.009);冬蟲(chóng)夏草樣品與亞香棒蟲(chóng)草樣品之間的差異尤為顯著(P＜0.000 6)。本研究是國(guó)內(nèi)外首次將穩(wěn)定同位素比值分析技術(shù)應(yīng)用于冬蟲(chóng)夏草產(chǎn)地鑒別的科研工作。

冬蟲(chóng)夏草穩(wěn)定同位素組成與產(chǎn)地的空氣密度、氣候、土壤和植被類型密切相關(guān)。冬蟲(chóng)夏草主要生長(zhǎng)于我國(guó)青藏高原及周邊地區(qū)海3 800～5 200 m的高寒草甸草皮層，生長(zhǎng)環(huán)境十分特殊，其在生長(zhǎng)成熟過(guò)程中不斷與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換。從冬蟲(chóng)夏草侵染幼蟲(chóng)到菌絲長(zhǎng)滿幼蟲(chóng)蟲(chóng)體的整個(gè)過(guò)程中，蟲(chóng)草處于土壤下，其體內(nèi)物質(zhì)組成受當(dāng)?shù)赝寥琅c植被影響較大，待蟲(chóng)草長(zhǎng)出子座后與空氣直接接觸，又受到當(dāng)?shù)乜諝?、雨水等其他氣候因素的影響，冬蟲(chóng)夏草體內(nèi)穩(wěn)定同位素受這些因素影響而發(fā)生自然分餾效應(yīng)，導(dǎo)致不同產(chǎn)地冬蟲(chóng)夏草體內(nèi)同位素自然豐度的差異。

本研究中不同產(chǎn)地冬蟲(chóng)夏草樣品的氮穩(wěn)定同位素比值具有顯著差異，原因就在于不同產(chǎn)區(qū)的空氣、土壤和植被等與冬蟲(chóng)夏草進(jìn)行氮元素交換的主要客體，以及影響氮元素交換效率的雨水、風(fēng)等氣候條件不同，引起不同來(lái)源的冬蟲(chóng)夏草體內(nèi)自然分餾效應(yīng)的差異。植被是對(duì)冬蟲(chóng)夏草碳穩(wěn)定同位素比值影響最大的因素，冬蟲(chóng)夏草寄主以植被根莖為主食，植被的碳同位素可通過(guò)食物鏈傳遞給蝙蝠蛾幼蟲(chóng)，并在其體內(nèi)代謝中進(jìn)一步分餾，使其同位素組成有所變化［10］。冬蟲(chóng)夏草均生長(zhǎng)于高寒草甸上，植被類型大體相同，因而碳穩(wěn)定同位素比值差異不明顯。但是，亞香棒蟲(chóng)草生長(zhǎng)于低海拔地區(qū)，其植被明顯不同于高海拔地區(qū)，這是其碳穩(wěn)定同位素比值不同于冬蟲(chóng)夏草的主要原因。

本研究所建立的氮穩(wěn)定同位素比值分析技術(shù)方法能快速有效鑒別冬蟲(chóng)夏草原產(chǎn)地，在冬蟲(chóng)夏草與其相似品的鑒別中也有潛在的應(yīng)用前景。但是，還需要進(jìn)一步廣泛收集不同的蟲(chóng)草測(cè)試樣品，獲得豐富的研究數(shù)據(jù)，并建立相應(yīng)的數(shù)據(jù)信息系統(tǒng)，為將該技術(shù)方法應(yīng)用于冬蟲(chóng)夏草的原產(chǎn)地鑒別提供重要的參考依據(jù)。

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