王莉娜，胡雪蓮

1(北京燕京啤酒集團(tuán)公司技術(shù)中心，北京，101300)

2(燕京啤酒啤集團(tuán)酒釀造技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，101300)

酚酸類化合物廣泛分布于各種植物體中，它是植物體重要的次生代謝產(chǎn)物。酚酸類化合物中的酚羥基是優(yōu)良的氫給予體，對(duì)過氧自由基(·OOH)、羥基自由基(·OH)等具有明顯的清除作用。由此，植物中的酚酸類化合物成為一種非常優(yōu)良的天然抗氧化劑。有研究表明，酚酸對(duì)人體具有抗氧化、抗自由基、抗炎、抗癌等一系列保健藥效功能。啤酒是以麥芽和啤酒花為釀造原料的低酒精類飲料，其中含有較豐富的酚酸類物質(zhì)。眾所周知，啤酒一經(jīng)灌裝，即開始了風(fēng)味逐漸惡化的過程，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，啤酒會(huì)逐漸出現(xiàn)令人不愉快的氧化味，目前國(guó)際上對(duì)氧化味的形成已基本達(dá)成共識(shí):認(rèn)為啤酒氧化味形成主要有6種途徑，包括啤酒中類黑精、不飽和脂肪酸等物質(zhì)的自氧化過程等。酚酸作為一類具有抗氧化功效的物質(zhì)，能夠延緩，甚至阻止氧化過程的發(fā)生［1-3］。因此對(duì)啤酒中酚酸類物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定在啤酒風(fēng)味穩(wěn)定性的研究中具有十分重要的意義。

對(duì)于酚酸的測(cè)定，已報(bào)道的分析方法主要有液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法、毛細(xì)管電泳法等，高效液相色譜法是目前較為常用的酚酸分析方法。但由于啤酒中酚酸含量較低，啤酒基體又十分復(fù)雜，因此準(zhǔn)確測(cè)定啤酒中酚酸的含量是一項(xiàng)十分困難的工作。通常需先行對(duì)啤酒中的酚酸進(jìn)行分離、富集等處理后，方可用于儀器分析。溶劑萃取濃縮是早年曾用的技術(shù)，劉群濤等采用乙酸乙酯萃取測(cè)定了啤酒的10種酚酸，但該法操作繁瑣，溶劑耗量大，檢測(cè)的靈敏度低［5］。比較而言，固相萃取是近年所用的更簡(jiǎn)捷有效的樣品前處理技術(shù)。2004年，García等人在無醇啤酒的酚酸分析中，采用Waters Sep Pak C18固相萃取柱作樣品的萃取凈化，測(cè)定了啤酒中10種酚酸組分，但該方法測(cè)定結(jié)果中大部分酚酸組分回收率較低，并且公認(rèn)對(duì)啤酒抗氧化能力具有重要作用的沒食子酸的回收率僅6%，且未在實(shí)際樣品檢測(cè)中均未能檢出［4］。2007年，DVOˇRáKOVá等人對(duì)6種固相萃取小柱的萃取凈化效果進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究，指出不同類型的固相萃取柱對(duì)啤酒中酚酸檢測(cè)的回收率和精密度有較大影響［6］。本研究采用SPE-HPLC方法，在研究比較了，并優(yōu)化了SPE柱的種類、淋洗操作及樣品pH等諸多條件后，著力解決了沒食子酸測(cè)定的瓶頸問題，同時(shí)將酚酸的檢測(cè)對(duì)象擴(kuò)大到15種，操作更加簡(jiǎn)便，靈敏度及準(zhǔn)確度都有了較大提高。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

沒食子酸、原兒茶酸、兒茶酸、對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯乙酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、表兒茶酸、丁香酸、對(duì)-香豆酸、阿魏酸、芥子酸、水揚(yáng)酸、肉桂酸、槲皮素等，采購(gòu)于SIGMA試劑公司。

Oasis HLB固相萃取柱(1 mL)，Oasis MAX固相萃取柱 (3 mL)，均購(gòu)于Waters公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀(2695型，帶有waters 2489紫外/可見檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司)，固相萃取裝置(WIN SPE12，北京萊伯泰科儀器公司)。

1.3 色譜條件

色譜柱 ZORBAX ODS柱 4.6 mm×250 mm，5 μm。流動(dòng)相A:0.1%乙酸-甲醇溶液，流動(dòng)相B:1%乙酸-水溶液。流動(dòng)相洗脫梯度程序:0～25 min，10% ～30%A;25 ～40 min，30%A;40 ～60 in，30% ～60%A;60～61 min，60% ～10%A;61～75 min，10%A。流速 v=1.0 mL/min，柱溫:30℃，檢測(cè)波長(zhǎng) 280 nm，進(jìn)樣量 10 μL。

1.4 標(biāo)樣的配制

混標(biāo)儲(chǔ)備液1:分別稱取0.05 g沒食子酸、原兒茶酸、對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯乙酸、綠原酸、阿魏酸、丁香酸、對(duì)香豆酸、咖啡酸于同一燒杯中，用甲醇溶解后，定容于100 mL容量瓶中，該標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度為500 mg/L。

混標(biāo)儲(chǔ)備液2:各稱取0.1 g肉桂酸、香草酸、兒茶酸、水揚(yáng)酸于同一燒杯中，用甲醇溶解后，定容于100 mL容量瓶中，該標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度為1 000 mg/L。

芥子酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:稱取0.01 g芥子酸，用甲醇溶解后定容至100 mL，該標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度為100 mg/L。

表兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:稱取0.001 g表兒茶酸，用甲醇溶解后定容至10 mL，該標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度為100 mg/L。

上述各標(biāo)準(zhǔn)溶液于4℃冰箱中儲(chǔ)存，各標(biāo)準(zhǔn)使用液現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.5 樣品制備

Waters Oasis HLB柱(1 mL)經(jīng)1 mL甲醇活化、l mL水(含1%乙酸)洗后，取1 mL經(jīng)超聲波除氣的啤酒樣品上樣，調(diào)整流速1 mL/min，然后再經(jīng)1 mL水(含1%乙酸)洗后，用2 mL酸化甲醇(含1%乙酸)洗脫，收集洗脫液，經(jīng)0.45 μm膜過濾后，上機(jī)檢測(cè)。

Waters Oasis MAX柱(3 mL)經(jīng)3 mL甲醇活化后，用3 mL水淋洗，取1 mL經(jīng)超聲波除氣的啤酒樣品上樣，用3 mL 2%的氨水淋洗以鎖定目標(biāo)，之后用3 mL甲醇淋洗;最后3 mL 2%的酸化甲醇洗脫，收集洗脫液，經(jīng)0.45 μm膜過濾后，上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取條件的優(yōu)化

2.1.1 固相萃取柱的選擇

酚酸是一類帶有酚類基團(tuán)的有機(jī)酸，具有一定的極性，在不同的溶劑中具有不同的分配系數(shù);同時(shí)酚酸又具有一定的弱酸性，在不同氫離子濃度下會(huì)保持不同的離解狀態(tài)。因此，在本文的研究中選取了反相HLB柱和離子交換模式的MAX柱兩種類型的萃取柱，以2 mg/L的混標(biāo)代替啤酒樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

使用HLB固相萃取柱的實(shí)驗(yàn)中，標(biāo)樣經(jīng)固相萃取操作后上機(jī)檢測(cè)，所有組分的回收率均大于90%。在使用MAX萃取柱的實(shí)驗(yàn)中，沒食子酸、兒茶酸、丁香酸均沒有流出，表兒茶酸回收率最高達(dá)到88%，其余組分的回收率則在20%～60%之間;當(dāng)使用酸性更強(qiáng)的三氯乙酸-甲醇作為洗脫液時(shí)，各組分的回收率可略有提升，但除表兒茶酸和香草酸回收率大于80%，其余組分回收率均較低。因此本文的研究選用HLB固相萃取柱作為樣品制備用小柱。

2.1.2 淋洗液的選擇

啤酒樣品上樣后，對(duì)萃取小柱進(jìn)行水淋洗以去除樣品中的干擾雜質(zhì)組分。圖1為經(jīng)過水洗與不經(jīng)水洗處理后的樣品色譜圖。從圖1可以明顯看出，水洗操作能有效去除樣品背景雜質(zhì)，其中對(duì)于沒食子酸色譜峰的準(zhǔn)確定量顯得尤為關(guān)鍵。

圖1 經(jīng)過水洗與不經(jīng)水洗處理后的樣品色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of samples with/without washing with water

為了考察水洗操作對(duì)于目標(biāo)組分的影響，本文以2 mg/L的混標(biāo)溶液替代樣品進(jìn)行固相萃取操作，接收淋洗液進(jìn)行酚酸含量分析，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，除沒食子酸外，其余酚酸化合物在水洗操作時(shí)均沒有流失。重復(fù)6次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算出沒食子酸損失率在7%～10%之間。

圖2 固相萃取過程水淋洗對(duì)于酚酸組分的影響對(duì)比圖Fig.2 Comparison chromatograms for the effect of washing on phenolic acid

本研究中對(duì)比了超純水與酸化水淋洗對(duì)沒食子酸的影響。配制2.0 mg/L的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，取兩支SPE固相萃取柱，按2.5中所述進(jìn)行上樣操作，其中一支用超純水淋洗，另一支用酸化水淋洗。實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。經(jīng)檢測(cè)，使用超純水淋洗的沒食子酸含量均值為1.45 mg/L，而使用酸化水淋洗的沒食子酸含量均值為1.92 mg/L。從中可以看出，淋洗用水的酸性會(huì)影響到對(duì)酚酸的測(cè)定，這是由于酚酸屬于弱酸性物質(zhì)，在不同氫離子濃度下會(huì)保持不同的離解狀態(tài)，當(dāng)樣品在酸性條件下時(shí)，酚酸主要以分子形式存在，所以在樣品萃取凈化過程中，應(yīng)避免酚酸以離子形式發(fā)生損失，因此，水洗操作步驟應(yīng)使用酸化水(含1%乙酸)。

2.1.3 樣品pH值對(duì)測(cè)定的影響

酚酸是一類有機(jī)弱酸，因此當(dāng)體系溶液中H+濃度增加時(shí)，會(huì)使酚酸物質(zhì)更大程度地呈分子形式存在。在固相萃取過程中，保持樣品在低pH值會(huì)更有利于酚酸類化合物在反向保留模式的萃取柱上的保留行為。文獻(xiàn)［4］和［6］在作SPE柱處理前需要將啤酒樣品的pH調(diào)為1.5，為了驗(yàn)證調(diào)節(jié)啤酒pH值對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，本文做了比較試驗(yàn)。取同一瓶啤酒樣品，經(jīng)超聲除氣后，其中一部分樣品用36%的鹽酸調(diào)至pH1.5，另一部分為原樣，兩者通過固相萃取處理后進(jìn)樣分析，檢測(cè)結(jié)果見表1。

由表1中看出，啤酒原樣和調(diào)整啤酒pH為1.5的樣品中酚酸測(cè)定結(jié)果沒有明顯差異。這是由于啤酒屬于弱酸性飲料，pH值通常在4.2～4.3，其緩沖容量很大，而酚酸化合物酸性較弱，在啤酒溶液中解離趨勢(shì)變小，主要以分子形式存在，因此進(jìn)一步強(qiáng)化啤酒樣品的酸性對(duì)于酚酸的分析結(jié)果不會(huì)產(chǎn)生影響，在本研究中未對(duì)啤酒的pH作調(diào)整。

2.2 組分的分離與定性

通過標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間比對(duì)并結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)樣品組分峰作定性分析。典型的混標(biāo)及啤酒樣品色譜圖見圖3。有文獻(xiàn)報(bào)道啤酒中含有一定量的槲皮素［4-6］，其來源為啤酒釀造大麥。肉桂酸則是另一來自酒花的酚酸化合物，在本研究中，肉桂酸的出峰保留時(shí)間與文獻(xiàn)中槲皮素的保留時(shí)間較為接近，為對(duì)組分峰的確切定性，進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。取同一經(jīng)脫氣的啤酒樣品分為3份，1份添加2 mg/L的肉桂酸，1份添加2 mg/L的槲皮素，最后1份最為本底，按2.3進(jìn)行樣品制備后上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果見表2。

表1 調(diào)酸與不調(diào)酸樣品的檢測(cè)結(jié)果(mg/L)Table 1 Phenolic acid content in beer and acidized beer

圖3 酚酸的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of phenolic acid

表2 肉桂酸和槲皮素的確證實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果Table 2 Corroboration test of cinnamic acid and quercetin

由表2結(jié)果可以看出，在單獨(dú)添加肉桂酸的樣品中，50.73 min處的色譜峰面積較本底峰面積有明顯增加，而單獨(dú)添加檞皮素的樣品中，50.73 min的色譜峰面積并無增長(zhǎng)。

為了更確切地驗(yàn)證槲皮素的出峰情況，配制了槲皮素的單標(biāo)溶液于相同色譜條件下進(jìn)行分析，其結(jié)果是在本文色譜條件下，槲皮素沒有出峰。推斷其原因可能是:槲皮素的水溶性差，在做樣品配制時(shí)需純甲醇溶劑才能保持溶液的澄清，而在本文中的色譜條件，甲醇流動(dòng)相的最大洗脫梯度僅達(dá)到60%，而這一梯度維持時(shí)間很短，在這一強(qiáng)度下不足以將槲皮素洗脫出來，這可能是造成其不出峰的原因，槲皮素應(yīng)吸附在柱內(nèi)未流出。

由此，在本文的色譜條件下，50.73 min處的色譜峰確認(rèn)為肉桂酸，而非槲皮素。

2.3 回歸方程、線性范圍與檢出限

配制含有15種酚酸組分的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在2.3色譜條件下依次進(jìn)樣，各組分的保留時(shí)間、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限見表3。

表3 15種酚酸組分的保留時(shí)間、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限Table 1 Retention time，linear equations，correlation coefficients，linear range and LODs of 15 phenolic acids

2.4 回收率與精密度

取同一瓶啤酒樣品，用HLB小柱按2.5方法處理后上機(jī)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次平行，計(jì)算測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。同時(shí)另取約20 mL啤酒樣品于100 mL容量瓶中，加入酚酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻，并在室溫下放置24 h，樣品測(cè)定前再充分混勻，按2.5方法進(jìn)行樣品制備，上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果見表4。

在做方法回收率的實(shí)驗(yàn)過程中，如加入標(biāo)準(zhǔn)樣品后將容量瓶上下倒置20次，即進(jìn)行樣品處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果是各酚酸組分的回收率僅在40～80%之間，遠(yuǎn)不能滿足方法要求。分析原因可能是，啤酒樣品酒精度低，加入的標(biāo)準(zhǔn)樣品與酒液沒有達(dá)到充分混勻和溶解的狀態(tài)。將搖勻后的加標(biāo)樣品于室溫下靜置24 h，進(jìn)行固相萃取前再充分振搖，然后進(jìn)行樣品測(cè)定，即得到表4中結(jié)果，測(cè)定的回收率良好。

表4 方法回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 4 Recovery and RSD of 15 phenolic acids

2.5 樣品的測(cè)定

選取了6種典型市售啤酒樣品測(cè)定酚酸含量，結(jié)果見表5。

表5 市售啤酒樣品酚酸含量檢測(cè)結(jié)果(mg/L)Table 5 Phenolic acids contents in 6 commercial beers

應(yīng)用本方法測(cè)定了6個(gè)市售啤酒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同啤酒中各酚酸物質(zhì)的含量有一定的區(qū)別，可能與其生產(chǎn)原料、加工工藝的不同有關(guān)。從總體來看，各啤酒中的沒食子酸、兒茶酸、丁香酸、對(duì)香豆酸和阿魏酸的含量較高。

3 結(jié)論

建立了啤酒中15種酚酸同時(shí)分離并定量的分析方法。使用Oasis HLB小柱對(duì)啤酒樣品進(jìn)行固相萃取處理，在優(yōu)化的條件下可有效提取啤酒中的酚酸化合物，使用酸化水對(duì)固相萃取柱進(jìn)行淋洗能有效去除啤酒中雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)組分分離的影響。本研究同時(shí)對(duì)槲皮素和肉桂酸的確切定性進(jìn)行了有效確認(rèn)。方法有較好的精密度和回收率，同時(shí)具有法操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好等特點(diǎn)，適用于啤酒中酚酸含量的準(zhǔn)確測(cè)定。至于啤酒酚酸與抗氧能力之間的相關(guān)性，則是下一步研究的目標(biāo)。

致謝:本研究的實(shí)驗(yàn)及論文撰寫得到了中國(guó)食品發(fā)酵研究院胡國(guó)棟教授和蔡心堯教授的大力幫助，在此表示感謝!

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