郭麗瓊，吳厚玖，竇華亭

1(西南大學柑橘研究所，重慶，400712)2(西南大學食品科學學院，重慶，400715)

葉酸屬于水溶性VB的一種，是人體內紅細胞發(fā)育成長不可缺少的因子之一。它能參與核苷酸的生物合成和氨基酸代謝，是維持生物體正常生命過程所必需的一類有機物［1］。葉酸具有預防腫瘤［2-4］、神經管畸形［5］、巨幼紅細胞貧血［6］和心血管疾病［7］等功能。葉酸具有多種衍生物形式，其中5-甲基四氫葉酸及其多聚谷氨酸鹽是葉酸在天然植物中存在的最主要形式。柑橘中含有豐富的葉酸資源，為了解柑橘不同品種、不同組織中的葉酸含量，本研究利用高效液相熒光檢測法測定9個不同品種柑橘的5-甲基四氫葉酸含量，并進行了分析比較。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柑橘品種 采收時間 采收地點奧林達夏橙 2012年5月28日 重慶市忠縣長葉橙 2013年1月11日哈姆林甜橙 2012年12月12日奉節(jié)臍橙 2012年12月27日早津溫州蜜柑 2012年10月29日臺灣椪柑 2013年1月11日梁平柚 2012年10月29日沙田柚 2012年12月12日尤力克檸檬 2012年10月29日重慶北碚歇馬鎮(zhèn)中國農業(yè)科images/BZ_135_562_2528_864_2528.png學院柑橘研究所

5-甲基四氫葉酸標準品，瑞士Schircks Laboratories公司;大鼠血清、雞胰腺凍干粉，上海物競化工科技有限公司;KH2PO4、抗壞血酸、H3PO4、醋酸鈉，成都科龍化工試劑廠;甲醇、乙腈(均為色譜純)，美國Sigma公司;2-巰基乙醇，天津市光復精細化工研究所;KOH，重慶北碚化學試劑廠;NaCl(分析純)，重慶川東化工(集團)有限公司。

1.2 儀器與設備

Dionex's Ultimate 3000高效液相色譜儀、熒光檢測器，戴安(上海)分析儀器有限公司;Venusil MP C18色譜柱，天津博納艾杰爾科技有限公司;恒溫水浴鍋，江蘇金壇市中大儀器廠;LDZX-50FBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海深諳醫(yī)療器械廠;CQ250超聲波清洗器，上海超聲波儀器廠;IEC CL31R冷凍離心機，德國ThermoFisher公司;SAX固相萃取小柱，上海安譜科學儀器有限公司;2X-2真空泵，南京真空泵廠;0.22 μm濾膜，天津津騰實驗設備有限公司;FE20 pH計，瑞士Mettler Toledo公司;FAZO04B電子分析天平，上海精科儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

精確稱取5-甲基四氫葉酸標準品2.0 mg于100 mL容量瓶中，用含1 g/100 mL抗壞血酸和體積分數(shù)(下同)0.1%2-巰基乙醇的0.1 mol/L KH2PO4溶液溶解并定容至刻度，即得20 μg/mL的標準儲備液。精密量取適量標準儲備液，用上述KH2PO4溶液依次配制成不同質量濃度梯度的系列標準溶液，測定各標準液的峰面積，并繪制標準曲線。

1.3.2 果實的采集

選取正常生長的植株，從試驗樹的東、西、南、北方位隨機采集果實10個供試驗分析。

1.3.3 果實常規(guī)品質指標的檢測

(1)單果重:稱重法。

(2)縱橫經:游標卡尺測量法。

(3)可滴定酸:根據(jù) GB 8210-1987［8］:指示劑法，用堿中和法測定可滴定酸表示的游離有機酸含量。將10個新鮮果實進行分部位處理，取混合后經勻漿處理的果肉樣品進行分析檢測，每個樣品平行測定3次。其可滴定酸以100 g果肉中檸檬酸的克數(shù)計。

(4)可溶性固形物:將10個新鮮果實進行分部位處理，取混合后經勻漿處理的果肉樣品利用手持測糖儀，在室溫為20℃條件下進行測定，每個樣品平行測定3次。

(5)水分含量的測定:將10個新鮮果實進行分部位處理并分別混合，利用直接干燥法測定其各部位的水分含量，每個樣品平行測定3次。

1.3.4 HPLC樣品處理

對樣品進行分部位檢測，將采集的10個新鮮果實洗凈，分離出柑橘果肉、囊衣、果皮、種子4部分，取各部位樣品適量分別進行混合，將果肉勻漿和果皮搗碎后分別裝在自封袋中，加入液氮使其快速凍結后放入黑色塑料袋中存放于-20℃冰箱貯藏，樣品存放不超過14 d。分析檢測時常溫解凍。

果肉處理［9］:準確稱取果肉3 g左右于125 mL三角錐瓶中，加20 mL萃取液(0.05 mol/L磷酸緩沖液，pH 6.8，含1%抗壞血酸和0.1%2-巰基乙醇)，水解條件為沸水浴15 min，其間不斷振蕩以使其充分水解，立即冰水冷卻后于4℃、12 000 r/m條件下離心30 min，取上清液3 mL加入葉酸軛合酶即大鼠血清0.5 mL后于37℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育20 h，再次以4℃、15 000 r/m的條件下離心20 min，將上清液于SAX固相萃取小柱進行純化后獲得提取液［10-11］，0.22 μm孔徑濾膜過濾，待測。

果皮、囊衣和種子的處理［9］:準確稱取樣品2～3 g于研缽中，加入液氮進行研磨，用25 mL萃取液將樣品轉移至125 mL三角錐瓶中，經振蕩沸水浴、離心、加酶、溫育、再次離心、純化等條件下獲得提取液，0.22 μm濾膜過濾，待測。

需要注意的是由于5-甲基四氫葉酸的不穩(wěn)定性，故在試驗過程中，需在暗光條件下，所有的器皿如三角錐瓶、容量瓶等最好用棕色的或將其用鋁箔紙包裹以避光，同時適量的VC和2-巰基乙醇作為抗氧化劑添加到萃取液中以保護5-甲基四氫葉酸，防止其氧化分解［12］。

1.3.5 測定

1.3.5.1 色譜條件

色譜柱:Venusil MP C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:V(乙腈)∶V(0.05 mol/L KH2PO4(pH 3.0))=6∶94;流速1.0 mL/min;柱溫23℃;進樣量20 μL;激發(fā)波長290 nm;發(fā)射波長360 nm。

1.3.5.2 樣品測定

每個樣品平行2次，采用反相高效液相熒光檢測法進行測定。

1.3.5.3 試驗數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel和Statistix軟件，分析各柑橘品種不同組織部位中5-甲基四氫葉酸含量。

2 結果與討論

2.1 果實的品質分析

本試驗選取了商品栽培的四大主要柑橘種即甜橙、寬皮桔、柚和檸檬為試材，以各自比較常見的品種作為試驗對象。分析各品種樣品的單果重、縱橫徑、水分、可溶性固形物、可滴定酸等指標，結果見表2～表4。甜橙的可溶性固形物較高，特別是長葉橙和奉節(jié)臍橙，其可溶性固形物達到12%以上。臺灣椪柑的可溶性固形物也較高，為11.9%;而尤力克檸檬最低，只有8.3%。尤力克檸檬中可滴定酸含量最高，而柚類果實中，可滴定酸含量最低，只有0.19 g/100 g果肉。所采樣品均在果實完全成熟后采摘，其品質指標都較好。

2.2 不同品種柑橘不同部位的5-甲基四氫葉酸的含量

試驗對柑橘不同品種的不同組織中5-甲基四氫葉酸的含量進行分析，結果如表5所示?？梢钥闯?，本試驗所測柑橘品種中，果實果肉中5-甲基四氫葉酸含量高的為甜橙類，其中哈姆林最高，為29.28 μg/100 g，奉節(jié)臍橙 27.77 μg/100 g，奧林達夏橙24.58 μg/100 g，長葉橙 23.31 μg/100 g。其次為柚類，沙田柚果肉中 5-甲基四氫葉酸的含量為23.45μg/100 g，與長葉橙和奧林達夏橙沒有顯著性差異，而梁平柚只有15.01 μg/100 g，與其余品種差異顯著。寬皮橘類果實果肉5-甲基四氫葉酸的含量較低，早津溫州蜜柑果肉中的5-甲基四氫葉酸含量為 15.58 μg/100 g，臺灣椪柑中含量為 8.92 μg/100 g，與其他品種差異顯著;尤力克檸檬果肉中的5-甲基四氫葉酸含量最低，只有4.1 μg/100 g，與其他品種差異顯著。

表2 不同品種果實單果重和橫縱徑Table 2 The weight and diameter of citrus

表3 不同品種果實果汁可溶性固形物和可滴定酸含量的變化Table 3 The soluble solid and titratable acid in pulp of citrus fruits

柑橘果實囊衣中5-甲基四氫葉酸的含量普遍比果肉中的少，只有奧林達夏橙、沙田柚和早津溫州蜜柑的囊衣中所含的5-甲基四氫葉酸與各自果肉的含量相差不大，都不超過1.0 μg/100 g，其余品種中，囊衣所含5-甲基四氫葉酸比果肉中低。在所測品種中，奧林達夏橙的囊衣中5-甲基四氫葉酸含量最高，為25.18 μg/100 g;最低的則為臺灣椪柑，只有6.22 μg/100 g。通過顯著性分析發(fā)現(xiàn)，長葉橙、奉節(jié)臍橙、早津溫州蜜柑、梁平柚和尤力克檸檬的囊衣中所含的5-甲基四氫葉酸含量沒有顯著性差異，奧林達夏橙和沙田柚囊衣中含5-甲基四氫葉酸差異不大，其余品種間差異顯著。

柑橘果實果皮中5-甲基四氫葉酸的含量相比于柑橘其他組織的含量低，奉節(jié)臍橙品種的果皮含20.52 μg/100 g，是本試驗所測品種中含量最高的，而最低含量的為檸檬果皮，只含有7.30 μg/100 g。通過顯著性分析發(fā)現(xiàn)，甜橙類果實果皮中，除了奉節(jié)臍橙外，其余3種果皮中5-甲基四氫葉酸的含量差異不顯著;溫州蜜柑和臺灣椪柑果實果皮中差異不顯著;梁平柚和沙田柚中的差異也不顯著。

表4 不同品種果實不同部位水分含量Table 4 Moisture content in various tissues of citrus fruits

柑橘果實種子中5-甲基四氫葉酸的含量普遍比其他組織的高，這可能與種子中水分含量較低有關，只有沙田柚種子的含量較其果肉和囊衣的低，僅有14.42 μg/100 g。其余品種種子中5-甲基四氫葉酸的含量都比較高，其中奧林達夏橙種子中的含量最高，有49.64 μg/100 g。通過顯著分析，哈姆林甜橙和尤力克檸檬種子中5-甲基四氫葉酸含量沒有顯著性差異，臺灣椪柑和梁平柚之間沒有顯著性差異，其余各品種間種子中5-甲基四氫葉酸的含量具有顯著性差異。

大多數(shù)品種中，不同組織5-甲基四氫葉酸含量趨勢為種子＞果肉＞囊衣＞果皮，甜橙類果實中5-甲基四氫葉酸的含量較其他品種的高。

由于本試驗所取試驗原料均為成熟果實，尚未了解柑橘果實發(fā)育過程中各組織中5-甲基四氫葉酸的消長情況，對柑橘果實葉酸利用還需進一步積累資料。此外，從試驗結果可以看出，不同品種的5-甲基四氫葉酸含量差異較大，其原因尚不清楚，需要進一步開展原料產地、栽培方式、氣候條件、土壤條件等對果實中5-甲基四氫葉酸含量影響的研究，探討柑橘類果實的5-甲基四氫葉酸與產地、氣候、土壤以及種植方式之間的相互關系，可以為柑橘及相關產品的品種溯源和營養(yǎng)源開發(fā)等提供技術支撐。

3 小結

甜橙類果實果肉中含5-甲基四氫葉酸最高，尤以哈姆林甜橙最高，為29.28 μg/100 g;其次為柚類;柑類品種果實果肉5-甲基四氫葉酸的含量較低;不同組織5-甲基四氫葉酸含量的基本排序為種子＞果肉＞囊衣＞果皮。

表5 不同品種果實不同部位5-甲基四氫葉酸的含量Table 5 Content of 5-methyltetrahydrofolate in various tissues of citrus fruits

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