康連虎，李呂木，，司雄元，李彬，郭文杰，穆華，丁小玲，許發(fā)芝

1(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽合肥，230036)2(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)中心，安徽 合肥，230036)

3(安徽瑞福祥食品有限公司，安徽 亳州，236800)4(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，安徽合肥，230036)

以小麥為原料生產(chǎn)酒精的過程中，小麥經(jīng)過粉碎、水洗、發(fā)酵以及蒸餾等過程生產(chǎn)出酒精，同時產(chǎn)生了酒精糟液，酒精糟液經(jīng)過離心分離，下層沉淀烘干做小麥干酒糟(小麥DDG)，上清液加入絮凝劑絮凝后過濾得浮渣，濾液進(jìn)行沼氣生產(chǎn)后得沼渣，浮渣和沼渣的產(chǎn)量大，且沼渣異味大，如直接丟棄勢必對環(huán)境造成很大污染。經(jīng)測定，浮渣和沼渣烘干后粗蛋白含量分別在27%和35%左右，丟棄處理實屬極大的浪費(fèi)。為了實現(xiàn)這部分資源的飼用化，近年來，安徽瑞福祥食品有限公司將菌泥與浮渣和麩皮混合，接種酒曲菌種進(jìn)行發(fā)酵，以降低菌泥的異味，提高其飼用品質(zhì)。但由于酒曲中菌種繁多，功能菌不夠明晰，不符合國家對發(fā)酵產(chǎn)品的微生物要求。同時酒曲發(fā)酵不耐高含水量(55%左右)而兩種殘渣含水量均在85%左右，這就要求在發(fā)酵時還需要添加大量吸水物料，如麩皮來降低整體含水量，而麩皮的添加又降低了發(fā)酵產(chǎn)物的蛋白含量。因此，優(yōu)選高效耐水分的飼用微生物進(jìn)行菌泥和浮渣的發(fā)酵，以去除其異味和提高其飼用品質(zhì)，對實現(xiàn)菌泥和浮渣無害化處理和資源化利用具有重要意義。安徽瑞福祥食品有限公司在先前的固態(tài)發(fā)酵浮渣和沼渣進(jìn)行飼用開發(fā)過程中發(fā)現(xiàn)發(fā)酵產(chǎn)物中富含小肽，已有研究證實有些小肽可以直接被吸收，且吸收的效果要比氨基酸好［1］，有些小肽還具有特殊的生物活性功能如抑制血壓升高［2］、抗疲勞［3］、增強(qiáng)免疫功能［4］及降低膽固醇［5］等作用，而這些作用均與其抗氧化性質(zhì)有關(guān)。為此，本研究通過對發(fā)酵菌種和發(fā)酵條件的優(yōu)化，以及發(fā)酵產(chǎn)物中小肽抗氧化活性研究，為開拓浮渣和菌泥的飼用開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

浮渣、沼渣、酒曲和麩皮，由安徽瑞福祥食品有限公司提供;地衣芽孢桿菌 D-1、枯草芽孢桿菌 KG-109，由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)飼料科技研究所提供。

藍(lán)色葡聚糖-2000、L-酪氨酸、還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽，北京索萊寶科技有限公司;Sephadex G-15，北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，上海源葉生物技術(shù)有限公司。

豪華型面包發(fā)酵箱，廣州市海締機(jī)械科技有限公司;752紫外-可見分光光度計，上海浦東物理光學(xué)儀器廠;DHL-A電腦恒流泵、HD-21-1核酸蛋白檢測儀、SBS-100自動液相色譜層析儀，上海青浦滬西儀器廠;層析柱(2.6 cm×60 cm)，上海錦華層析設(shè)備廠;多功能有機(jī)膜實驗設(shè)備，合肥世杰膜工程有限責(zé)任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 固態(tài)發(fā)酵

試驗以菌泥、浮渣為原料，輔以麩皮，使用本實驗室保存的耐水和盛產(chǎn)蛋白酶的飼用微生物菌種地衣芽孢桿菌D-1、枯草芽孢桿菌KG109和混合菌種酒曲3種出發(fā)菌進(jìn)行固態(tài)好氧發(fā)酵，依次為處理1、2和3，處理1和處理2的接種量設(shè)3%和6%兩個梯度，每個梯度含水量設(shè)50%、60%、70%三個水平，處理3按照瑞福祥公司先前優(yōu)化的酒曲最優(yōu)發(fā)酵條件不變，即接種量10%，物料水分50%，菌泥:浮渣∶麩皮=10%:10%∶70%(以干物質(zhì)計)。共 13個組合(表1)。將原料混勻后在墊有無紡布的有孔不銹鋼托盤內(nèi)堆成20×20×20的料堆在面包箱內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵，初始發(fā)酵溫度34℃，每3個小時測1次溫度，每12 h翻盤通風(fēng)，發(fā)酵48h。發(fā)酵結(jié)束后取樣65℃烘干制樣測水分、粗蛋白和酸溶蛋白含量。以物料水分高和產(chǎn)小肽量多為最優(yōu)組合，其樣品用于后續(xù)的小肽分離純化及其抗氧化活性研究。

表1 發(fā)酵組合Table 1 Combinations cf fermentation

1.2.2 小肽粗提

準(zhǔn)確稱取物料水分高和產(chǎn)小肽多的最優(yōu)組合殘渣發(fā)酵物20g加180 mL純水，攪拌混勻浸提20 min，濾紙過濾后取濾液8 000 r/min離心15 min，取上清液過0.45 μm濾膜，取濾液過1 000 Da納濾膜，得到分子質(zhì)量小于1 000 Da部分濃縮備用。

1.2.3 小肽分離純化

采用Sephadex G-15葡聚糖凝膠層析柱對小肽粗體液進(jìn)行分離純化。層析柱(2.6 cm×60 cm)，小肽粗提液質(zhì)量濃度為30 mg/mL，上樣量為l.0 mL，使用雙蒸水做洗脫液，流速為0.5 mL/min，檢測波長為280 nm。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用任穎和彭惠惠等［6-7］的方法。

1.2.5 小肽含量測定

采用 Lowry-福林酚法［8］，重復(fù)測定2次。

1.2.6 體外抗氧化指標(biāo)測定

DPPH自由基清除作用的測定、·OH清除作用的測定和還原力測定均采用彭惠惠等［7］方法。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗中數(shù)據(jù)用x±s表示，使用Microsoft Excel表格整理計算，使用SAS 9.1對結(jié)果進(jìn)行分析，P＜0.05和P＜0.01分別表示差異顯著和極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵物指標(biāo)檢測

菌種、接種量和物料水分對產(chǎn)物酸溶蛋白和粗蛋白的影響見表2，可見酸溶蛋白含量和粗蛋白含量均是3組和6組顯著高于其他組(P＜0.01)，但3組和6組差異不顯著(P＞0.05)，而3組接種量較少，因此3組的發(fā)酵條件即為最優(yōu)組合，即選擇D-1為菌種，3%接種量，含水量70%。此組發(fā)酵樣絕干狀態(tài)下粗蛋白含量31.75%，酸溶蛋白含量14.63%。

表2 菌種、接種量和物料水分對產(chǎn)物酸溶蛋白和粗蛋白的影響Table 2 Effect of strains，inoculum content and moisture on acid soluble protein and crude protein of fermentation production

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

測得外水體積V0=81.50 mL，總體積Vt=221.80 mL，L-酪氨酸(M=181.19)、還原型谷胱甘肽(M=307.32)、氧化型谷胱甘肽(M=612.6)的洗脫體積Ve分別為258.43、185.21、111.82 mL。所作標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，擬合得到回歸方程:y=-0.506 3x+2.885 0，式中y為標(biāo)準(zhǔn)品相對分子質(zhì)量的對數(shù)(lgM)，x為Kav系數(shù)，Kav=(Ve-V0)/(Vt-V0)。回歸方程的相關(guān)系數(shù)為0.994 3，說明lgM與Kav線性關(guān)系較好。

圖1 lgM與Kav系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of lgM and Kav

2.3 Sephadex G-15檢測小肽的相對分子質(zhì)量分布

小肽粗提液經(jīng)過Sephadex G-15凝膠色譜柱分離，出現(xiàn)5個峰，如圖2所示，各個峰的洗脫體積分別是72.43、88.35、130.31、158.52、199.21 mL，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的方程，得到5個組分的分子質(zhì)量分別為827、725、512、405、289 Da，即小肽粗提液分離得到的5 個組分為八肽、七肽、五肽、四肽、三肽。繼續(xù)分離純化并將收集的5個組分冷凍保存，作下一步分析使用。

圖2 小肽Sephadex G-15柱層析洗脫圖譜Fig.2 Elution profile of small peptide on Sephadex G-15

2.4 小肽對DPPH·的清除作用

由圖3可知，在高質(zhì)量濃度(1.0 mg/mL)條件下小肽粗提液的DPPH自由基清除率極顯著(P＜0.01)高于2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT);但在低質(zhì)量濃度(0.1 mg/mL)條件下，小肽粗提液的DPPH·清除率與BHT差異不顯著。表明小肽具有進(jìn)一步開發(fā)為高效抗氧化劑的潛力。

圖3 小肽粗提液與BHT清除DPPH自由基能力的比較Fig.3 Scavenging capacity of small peptide and BHT on DPPH free radicals

由圖4可知，小肽粗提液及分離得到的七肽、五肽、四肽和三肽均具有清除DPPH·的能力，并且在試驗所設(shè)梯度范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增加DPPH·清除能力也在增加。四肽、五肽與小肽粗提液對DPPH·的清除能力接近且較高，七肽次之，三肽較弱。在高質(zhì)量濃度下，四肽、五肽的DPPH·清除率達(dá)到80%左右，小肽粗提液的DPPH·清除率超過90%。而八肽不具有清除DPPH·的能力。根據(jù)四肽、五肽和七肽對DPPH·清除的能力的規(guī)律，初步可以推斷對于質(zhì)量濃度相同、分子質(zhì)量不同的小肽而言，清除DPPH·的能力隨著小肽分子質(zhì)量的減小而增大。上述結(jié)果與彭惠惠和范遠(yuǎn)景等［8，10-11］關(guān)于“小分子質(zhì)量多肽的抗氧化活性要明顯高于大分子質(zhì)量的多肽”的研究結(jié)果一致。這主要是因為抗氧化活性肽含有某些能與自由基反應(yīng)的特殊基團(tuán)即供氫基團(tuán)，只有當(dāng)小肽在適當(dāng)分子質(zhì)量時，這些特殊的供氫基團(tuán)才能得到最大的暴露充分與自由基作用，此時才具有較強(qiáng)的抗氧化性。由于八肽不具有抗氧化活性且溶液自身有一定的顏色，所以當(dāng)DPPH溶液中加入一定濃度的八肽時，八肽溶液自身的顏色導(dǎo)致吸光度沒有減小反而增大，因此顯示清除率為負(fù)值。

圖4 小肽對DPPH·清除作用的比較Fig.4 Scavenging capacity of small peptide on DPPH free radicals

2.5 小肽對·OH的清除作用

從圖5可以看出，在試驗所設(shè)梯度(0.1～1 mg/mL)范圍內(nèi)，小肽粗提液及分離得到的七肽、五肽、四肽和三肽對·OH均有清除作用，并且在較低濃度范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增加，小肽對·OH的清除作用也隨之增強(qiáng)，當(dāng)達(dá)到一定濃度后，質(zhì)量濃度增加而清除率不再繼續(xù)增加。小肽中含有供氫體，具有提供質(zhì)子的能力，使具有高度氧化性的自由基還原，從而達(dá)到終止自由基連鎖反應(yīng)，起到清除或抑制自由基的目的，因此，隨著質(zhì)量濃度的增加，供氫體增多，提供質(zhì)子的能力增強(qiáng)，其抗氧化性也就會隨之提高。當(dāng)達(dá)到一定濃度后，·OH已經(jīng)接近完全清除而不再增加。在高質(zhì)量濃度下，凝膠層析分離所收集的組分中，四肽清除·OH能力最強(qiáng)接近100%，粗提液和五肽清除率均達(dá)到90%以上。三肽較弱，在質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL時，清除·OH能力在34%左右，且隨著質(zhì)量濃度的增加而沒有明顯的增強(qiáng)。八肽不具有清除·OH的能力。

圖5 小肽對·OH清除作用的比較Fig.5 Scavenging capacity of small peptide on hydroxyl free radicals

2.6 小肽還原力

由圖6可知，除了八肽的其他各組分在試驗所設(shè)梯度(0.5～5 mg/mL)范圍內(nèi)總還原力與質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系。隨著小肽質(zhì)量濃度的增加，小肽的抗氧化性也隨之增強(qiáng);凝膠層析分離所收集的各組分中，四肽的還原力最強(qiáng)，這一結(jié)果與清除DPPH·、·OH活性一致。以還原型谷胱甘肽作為對照，其總還原力高于小肽各組分。5 mg/mL的小肽粗提液和四肽與0.5 mg/mL谷胱甘肽的吸光度相近，說明這些物質(zhì)的總還原力相近。

圖6 小肽還原力的比較Fig.6 Total reducing power of small peptide

大量研究資料證明，炎癥、腫瘤、衰老、血液病以及心、肝、肺、皮膚等各方面疑難疾病的發(fā)生機(jī)理均與體內(nèi)自由基產(chǎn)生過多或清除自由基能力下降有著密切的關(guān)系［10］。為此，高效、天然無毒的抗氧化劑一直是研究人員致力研究的課題。本實驗中從固態(tài)發(fā)酵浮渣和沼渣所得產(chǎn)物中提取的小肽粗提液以及分離出的大多數(shù)肽組分均具有較強(qiáng)的清除自由基的能力。由以上3種抗氧化實驗結(jié)果分析可以看出，在不同的實驗體系中，四肽抗氧化能力最強(qiáng)，在水系中小肽總還原力低于谷胱甘肽，但在油系中小肽清除DPPH自由基活力高于BHT，因此小肽在油脂抗氧化方面值得今后深入研究。對于還原力較強(qiáng)的四肽、五肽和七肽，對·OH和DPPH自由基均具有較強(qiáng)的清除作用，且抗氧化能力隨著小肽分子質(zhì)量的降低而增強(qiáng)，可見小肽的抗氧化活性與其分子質(zhì)量存在相關(guān)關(guān)系。然而，三肽和八肽抗氧化能力很弱或基本為零，且與抗氧化能力隨著小肽分子質(zhì)量的降低而增強(qiáng)的規(guī)律并不相符，可能是由于多肽的抗氧化能力與構(gòu)成肽的氨基酸種類、數(shù)量及氨基酸排列有關(guān)。許多氨基酸及其衍生物有清除自由基的能力，如:Lys、His、Tyr、Met、Pro、Arg、Glu、Cys等，而含有 Tyr、His、Lys、Pro 等氨基酸的多肽一般具有較強(qiáng)的抗氧化活性［11-12］。而本實驗中分離出的三肽和八肽中可能只含有少量的或不含有抗氧化活性較強(qiáng)的氨基酸，因此其抗氧化能力很弱以至于不具有清除DPPH·和·OH的能力。

小肽富含供氫體，具有提供質(zhì)子的能力，可以使具有高度氧化性的自由基還原，從而終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，起到清除或抑制自由基的目的。這些都可能是小肽具有較強(qiáng)抗氧化作用的原因，但其詳細(xì)的抗氧化機(jī)理和構(gòu)效關(guān)系還需要進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

地衣芽孢桿菌D-1是提高小麥制酒精殘渣飼用品質(zhì)的高效發(fā)酵菌種，其固態(tài)發(fā)酵過程中產(chǎn)生的小肽中大部分具有較強(qiáng)抗氧化活性。

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