廖云莉，夏金梅，劉榮麗，許建中，徐洵，許晨

1(廈門大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建廈門，361102)

2(國家海洋局第三海洋研究所，福建 廈門，361005)3(福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建福州，360122)

海洋微生物生存于高壓、缺氧、避光、低溫、貧營養(yǎng)的特殊生境，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物具有化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣性和生物活性多樣性［1］。我國2008年啟動(dòng)海洋微生物資源的戰(zhàn)略性勘探與挖掘，目前，中國海洋微生物菌種保藏管理中心已經(jīng)收集保藏了10萬余株海洋微生物菌種，為新化合物的發(fā)現(xiàn)提供了重要資源保障。開發(fā)利用海洋微生物資源，重要的途徑之一是大批量規(guī)模發(fā)酵海洋微生物，高通量分離制備其小分子代謝產(chǎn)物以供藥物活性篩選，增加發(fā)現(xiàn)活性化合物和藥物先導(dǎo)化合物的可能性。

微生物發(fā)酵液組成非常復(fù)雜，通常情況下，發(fā)酵液中目標(biāo)物濃度很低，同時(shí)存在大量菌體細(xì)胞、培養(yǎng)基及其水解產(chǎn)物、金屬離子、生成的蛋白質(zhì)和多糖等膠狀物、色素等，嚴(yán)重干擾海洋微生物小分子代謝產(chǎn)物的獲取與制備。因此，需要對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理以除去絕大多數(shù)的干擾物質(zhì)，從而高效獲取目標(biāo)產(chǎn)物［2-3］。發(fā)酵液的預(yù)處理方法多種多樣，分別適用于不同場(chǎng)合，其中絮凝除雜的方法操作簡便易行、能耗低、所用設(shè)備及藥劑成本低廉、易于與離心分離和膜分離等其它方法耦合使用，是工業(yè)上提取某單一目標(biāo)產(chǎn)物常用的發(fā)酵液預(yù)處理方法［4］。目前，針對(duì)大批量不同的海洋微生物發(fā)酵液體系，以獲取全組分小分子代謝產(chǎn)物為目的的發(fā)酵液的預(yù)處理方法尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，建立一種通用的、高效的、快捷的、能預(yù)處理大批量大體積海洋微生物發(fā)酵液的方法，對(duì)高通量分離制備小分子代謝產(chǎn)物具有重要意義。

由于細(xì)菌菌體極小，固液分離十分困難，本實(shí)驗(yàn)采用絮凝技術(shù)使菌體聚集，增大懸浮顆粒體積，以提高過濾速率和濾液質(zhì)量。配合后續(xù)提取分離，以蛋白和多糖的去除率、小分子代謝產(chǎn)物的保留量為指標(biāo)，篩選和確定了一種絮凝耦合膜超濾處理發(fā)酵液的方法，建立了能適用于大多數(shù)不同海洋細(xì)菌發(fā)酵液的快速預(yù)處理工藝，為高通量制備海洋微生物小分子代謝產(chǎn)物，構(gòu)建海洋微生物代謝產(chǎn)物餾分庫奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Al2(SO4)3·18H2O、Fe2(SO4)3、CaCl2、Na2HPO4·12H2O(分析純)，西隴化工股份有限公司;陰離子聚丙烯酰胺(CPAM)、陽離子聚丙烯酰胺(PAM)(分子質(zhì)量≥300萬)，北京康普匯維科技有限公司;聚合氯化鋁、殼聚糖(化學(xué)純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲醇、乙酸乙酯(分析純)，汕頭市達(dá)濠精細(xì)化學(xué)品有限公司;甲醇(色譜純)，美國SPECTRUM CHEMICAL MFG.COPR。

1.2 儀器設(shè)備

圓形平板超濾膜(平均孔徑30 nm)，廈門新世膜環(huán)保科技有限公司;UV-9100型紫外-分光光度計(jì)，北京北分天普儀器技術(shù)有限公司;GL-21M高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司;GQ75高速管式離心機(jī)，上海浦東天本離心機(jī)械有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52A，上海亞榮生化儀器廠;Waters(Model 510)液相色譜儀，美國Waters公司;電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(icp-ms7500ce)，安捷倫公司;JA4103電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 絮凝實(shí)驗(yàn)［5］

取100 mL發(fā)酵液于250 mL燒杯中，加入一定量的絮凝劑，快速攪拌30 s后再慢速攪拌2 min，調(diào)節(jié)pH值至6，靜置30 min后取上清液用濾紙過濾并測(cè)定前2 min的濾液體積，計(jì)算濾速，離心后測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)、多糖含量和透光率，根據(jù)分析結(jié)果確定合適的絮凝pH值和絮凝劑用量［6］。

1.3.2 蛋白含量測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法［7］。

1.3.3 多糖含量測(cè)定

采用 DNS 法［8］。

1.3.4 濾速測(cè)定［9］

取發(fā)酵液絮凝后的上清液，在常壓下過0.45 μm中性濾紙，測(cè)前2 min的濾液體積，并計(jì)算濾速。

1.3.5 透光率測(cè)定［9］

取發(fā)酵液絮凝并離心后的上清液，以水為空白，在610 nm下測(cè)定透光率。

1.3.6 絮凝劑絮凝對(duì)小分子代謝產(chǎn)物提取的影響

取3份發(fā)酵液，每份100 mL，一份加Al2(SO4)3絮凝，一份加聚合氯化鋁絮凝，另一份不做任何處理，均采用離心法進(jìn)行固液分離(8 000 r/min，10 min)。提取3份上清液中的小分子代謝產(chǎn)物，粗提物干燥后分別溶解定容至10 mL，取 1 mL進(jìn)行HPLC檢測(cè)。同時(shí)，將離心后固形物用甲醇∶乙酸乙酯(20∶80)混合溶劑200 mL浸泡24 h后超聲30 min，離心后取上清液濃縮干燥;將干燥后的樣品分別溶解定容至10 mL，取1 mL進(jìn)行HPLC檢測(cè)。

1.3.7 鋁離子殘留量測(cè)定

取2份發(fā)酵液，每份100 mL，一份用Al2(SO4)3絮凝，另一份不做任何處理，8 000 r/min離心10 min，提取上清液中的小分子代謝產(chǎn)物，將粗提物進(jìn)行消解［10］，消解液定容于25 mL容量瓶中，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)檢測(cè)的含量。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 絮凝劑

2.1.1 不同絮凝劑去除蛋白、多糖的比較

不同絮凝劑去除蛋白和多糖的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。從表中可以看出:Al2(SO4)3、聚合氯化鋁、殼聚糖的蛋白去除效率都較高，均達(dá)到80%以上，Na2HPO4、CPAM(陽離子聚丙烯酰胺)、PAM(聚丙烯酰胺)、聚合氯化鋁對(duì)多糖的去除效果較好，均達(dá)到83%以上。從透光率和濾速來看，Al2(SO4)3和聚合氯化鋁的濾速明顯高于其它絮凝劑。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Al2(SO4)3和聚合氯化鋁的蛋白、多糖除去率高，濾速快，澄清度好，符合本實(shí)驗(yàn)要求。因此，考慮兼顧各種指標(biāo)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇Al2(SO4)3和聚合氯化鋁為絮凝劑，進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)比較。

表1 不同絮凝劑的絮凝效果Table 1 The flocculation of the different flocculants

2.1.2 絮凝劑使用對(duì)小分子代謝產(chǎn)物提取的影響

按1.3.6的方法分別提取Al2(SO4)3絮凝發(fā)酵液、聚合氯化鋁絮凝發(fā)酵液、未絮凝處理發(fā)酵液上清液中的次級(jí)小分子代謝產(chǎn)物，獲得的指紋圖譜見圖1，相應(yīng)的固形物提取的小分子代謝產(chǎn)物指紋圖譜見圖2。從圖1可以看出，Al2(SO4)3絮凝組與未作處理組的色譜峰基本吻合，聚合氯化鋁絮凝組的色譜峰在15～25 min和40～45 min與未作處理組的色譜峰吻合度不高;從圖2可以看出，Al2(SO4)3絮凝組與未作處理組提取物的色譜峰基本重合，表明Al2(SO4)3絮凝對(duì)小分子代謝產(chǎn)物組成與含量基本無不利影響;而聚合氯化鋁絮凝組提取物的色譜峰在9～12.5 min段的色譜峰信號(hào)明顯降低，某些組分提取含量減少，可能聚合氯化鋁絮凝劑或絮凝產(chǎn)生的固型物對(duì)小分子代謝產(chǎn)物有吸附作用，因此，選擇Al2(SO4)3作為發(fā)酵液的絮凝劑更適宜。

2.1.3 鋁離子在粗提物中殘留量的考察

圖1 上清液粗提物的色譜圖比較Fig.1 Contrasting the chromatograms of the crude extracts from the supermatant

圖2 固形物萃取液的色譜比較圖Fig.2 Contrasting the chromatograms of the extracts from the solid content

Al2(SO4)3絮凝處理與未絮凝處理的發(fā)酵液粗提物中鋁離子含量比較結(jié)果如表2所示，從表中數(shù)據(jù)可以看出，采用Al2(SO4)3絮凝發(fā)酵液，由上清液提取的小分子代謝產(chǎn)物中金屬Al3+含量與未經(jīng)絮凝的發(fā)酵液上清液提取的小分子代謝產(chǎn)物中的金屬鋁離子含量在同一數(shù)量級(jí)水平，而且沒有明顯增加，說明小分子代謝產(chǎn)物粗提物中金屬鋁離子的貢獻(xiàn)并不是來源于Al2(SO4)3絮凝劑。

表2 粗提物中的Al3+含量比較Table 2 Contrasting the Al ion content of the crude extracts

2.2 絮凝條件的確定

2.2.1 pH值對(duì)絮凝的影響

固定絮凝劑用量、溫度等其它操作條件，在4～9之間改變pH值，分別靜置30 min后取上清液測(cè)過濾速率，8 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min后取上清液測(cè)定蛋白和多糖含量、610 nm的透光率。不同pH值條件下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示(A、B、C、D分別表示pH對(duì)蛋白去除率、多糖去除率、透光率、濾速的影響)。從圖3-A可以看出，隨著pH值的升高，蛋白去除率降低，pH＞6時(shí)，蛋白去除率急劇下降;從圖3-B可看出，pH值變化對(duì)多糖去除率影響不大;從圖3-C可知，隨pH的增大透光率先降低，pH＞7后緩慢升高;從圖3-D可以看到，pH＜6時(shí)，隨pH升高濾速增加，pH為6～7時(shí)，隨 pH升高濾速下降，pH為7～8時(shí)，隨pH升高濾速升高，pH＞8時(shí)，隨pH升高濾速下降，濾速呈波動(dòng)狀態(tài)。pH值可影響Al3+的游離狀態(tài)，Al3+含量高，蛋白質(zhì)的凝聚能力強(qiáng)，Al(OH)3含量高，吸附絮凝能力強(qiáng)。低pH值時(shí)，Al3+含量高，蛋白質(zhì)凝聚能力強(qiáng)，但Al(OH)3含量低，吸附絮凝能力弱，溶液中的細(xì)小顆粒多，因此蛋白去除率高，但濾速低;而隨pH值增大，Al3+含量降低，Al(OH)3含量增加，蛋白凝聚能力弱，吸附絮凝能力增強(qiáng)，因此蛋白去除率降低，濾速增加，pH進(jìn)一步增大時(shí)，生成了偏鋁酸，Al3+和Al(OH)3的含量均減少，因此蛋白去除率仍下降，同時(shí)可溶性蛋白的含量升高會(huì)使濾速降低。綜合考慮，選擇絮凝pH值為6。

圖3 pH值對(duì)Al2(SO4)3絮凝效果的影響Fig.3 Effect of pH on the floccucation effect of aluminum sulfate

2.2.2 溫度對(duì)絮凝的影響

固定絮凝劑用量、pH值等其他操作條件，讓溫度在25～45℃之間變化，靜置30 min后，取上清液測(cè)過濾速率，8 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min后取上清液測(cè)定蛋白和多糖含量以及610 nm的透光率。結(jié)果如圖4所示(A、B、C、D分別表示溫度對(duì)蛋白去除率、多糖去除率、透光率、濾速的影響)。在25～45℃，隨溫度升高，蛋白多糖去除率、透光率以及濾速均略有增加，但是影響不明顯，因此，在25～45℃可以根據(jù)具體情況設(shè)定絮凝溫度。

圖4 溫度對(duì)Al2(SO4)3絮凝效果的影響Fig.4 Effect of temperature on the floccucation effect of aluminum sulfate

2.2.3 絮凝劑用量的確定

采用上述實(shí)驗(yàn)確定的最適溫度和 pH，使 Al2(SO4)3用量在100～300 μg/L之間變化，其他操作條件保持一致，靜置30 min后取上清液測(cè)定過濾速率，離心后取上清液測(cè)定蛋白質(zhì)和多糖含量、610 nm透光率。以蛋白去除率和透光率均大于(或等于)80%為標(biāo)準(zhǔn)確定Al2(SO4)3的用量，建立發(fā)酵液中蛋白含量與Al2(SO4)3用量的關(guān)系，結(jié)果如表3所示。從表3可以看出，細(xì)菌發(fā)酵液中蛋白含量與Al2(SO4)3用量存在一定的關(guān)聯(lián)性，即發(fā)酵液中蛋白含量較高時(shí)為達(dá)到一定的蛋白去除率所需要的Al2(SO4)3用量也較高，但蛋白質(zhì)含量在一定范圍內(nèi)時(shí)，Al2(SO4)3用量多，蛋白去除率反而降低。盡管如此，仍可以通過蛋白質(zhì)的含量大致判斷Al2(SO4)3的用量，該結(jié)果對(duì)細(xì)菌發(fā)酵液的快速預(yù)處理可提供有效的參考。

表3 海洋細(xì)菌發(fā)酵液中蛋白含量與Al2(SO4)3用量的關(guān)系Table 3 The relation of the protein content of fermentation borth of marine bacterias and the dosage of aluminum sulfate

2.3 海洋細(xì)菌發(fā)酵液固液分離方法的探究

2.3.1 不同固液分離方法的比較

采用上述確定的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行發(fā)酵液的絮凝，發(fā)酵液靜置30 min后，分別采用管式離心機(jī)(20 000 r/min，2.5 L/h)、臺(tái)式離心機(jī)(8 000 r/min，離心 5 min)、0.45 μm濾紙(中速)(模擬0.45 μm 的陶瓷膜過濾)、平板超濾膜(平均孔徑30 nm)進(jìn)行固液分離，取上清液測(cè)定過濾速率、蛋白和多糖含量、透光率，4種固液分離方式的效果如圖5所示(A、B、C、D分別表示對(duì)蛋白去除率、多糖去除率、透光率、濾速的影響)。從圖A、B可以得知，平板超濾膜的蛋白和多糖去除效果最好，其次是管式離心;從圖C可以看出，經(jīng)過平板超濾膜過濾后的濾液透光率遠(yuǎn)大于其他3者，臺(tái)式離心與管式離心的濾液透光率相差不大，0.45 μm濾紙過濾的濾液效果透光率極低;從圖D可以看出，采用平板超濾膜過濾的濾液再次過濾紙的速率明顯高于其他3種方式，管式離心的濾液過濾紙的速度大于臺(tái)式離心的濾液過濾紙的濾速。平板超濾膜過濾的綜合效果明顯優(yōu)于其他3種固液分離方式，蛋白去除率達(dá)到98.7%，多糖去除率達(dá)到82.2%，透光率達(dá)到98%，而且濾速明顯較高。細(xì)菌的細(xì)胞很小，破碎后碎片更小，采用0.45 μm的濾紙過濾時(shí)，由于膜孔較大，小顆粒粒子能進(jìn)入膜孔，使膜孔被堵，同時(shí)可溶性蛋白和多糖大部分可以通過，固液分離效果差;臺(tái)式離心機(jī)適合樣品量少的發(fā)酵液的處理，且不能連續(xù)進(jìn)料;管式離心機(jī)可以連續(xù)進(jìn)料，但較適合固體懸浮顆粒的液體，且進(jìn)料過程中泵的脈沖會(huì)破壞絮團(tuán)，操作不方便，噪音大;本實(shí)驗(yàn)使用的平板超濾膜平均孔徑為30nm，對(duì)小粒子有很好的截留作用，并能截留一部分可溶性蛋白和多糖，使用幾十次后膜通量變化不大，過濾時(shí)不會(huì)破壞絮團(tuán)，并且操作簡單方便，安全，能耗低，膜清洗也方便，具有很大優(yōu)勢(shì)。缺點(diǎn)是膜比較脆弱，不能耐堿，使用pH值不宜超過8。

圖5 固液分離方式的效果比較Fig.5 Contrasting the effect of the way of solid-liquid separation

2.3.2 絮凝處理對(duì)膜超濾的影響

分別取絮凝處理與未絮凝處理的發(fā)酵液2.5 L進(jìn)行膜超濾，每0.5 min讀取一次濾液體積，以時(shí)間對(duì)剩余發(fā)酵液百分比作曲線，同時(shí)分別測(cè)定濾液的各項(xiàng)指標(biāo)值。絮凝與未絮凝發(fā)酵液的過濾速率變化如圖6所示，表征絮凝與未絮凝效果的參數(shù)結(jié)果如表4所示。從圖6的速率曲線可得知，剩余85%發(fā)酵液時(shí)絮凝組與未絮凝組用時(shí)均約為1 min，相差不大;剩余60%發(fā)酵液時(shí)，絮凝組用時(shí)2.5 min，而未絮凝組用時(shí)4.5 min，絮凝組的濾速比未絮凝組快了1.8倍;剩余40%發(fā)酵液時(shí)，絮凝組用時(shí)5 min，而未絮凝組用時(shí)13.5 min，絮凝組的濾速比未絮凝組快了2.7倍。兩者的濾速前1 min內(nèi)相差不大，隨后差別越來越大，因?yàn)槲葱跄M發(fā)酵液中的細(xì)小菌體及其碎片堵塞了膜孔致使濾速越來越慢，膜通量越來越低，因此進(jìn)行絮凝預(yù)處理后，有效減少了膜的污染，提高了過濾速率。從表4可以看出，經(jīng)過絮凝后，膜過濾上清液的澄清度、蛋白去除率以及多糖去除率、濾速明顯優(yōu)于未絮凝的膜過濾上清液。

圖6 絮凝與未絮凝膜超濾速率變化曲線Fig.6 Comparing with the variation of membrane ultrafitration rate of flocculation treatment and flocculation untreatment

表4 絮凝與未絮凝處理效果比較表Table 4 Effect comparion of locculation treatment and flocculation untreatment

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以蛋白和多糖去除率、透光率、濾速為指標(biāo)，結(jié)合提取到的次級(jí)代謝產(chǎn)物的指紋圖譜，篩選出適合海洋細(xì)菌發(fā)酵液預(yù)處理用的Al2(SO4)3絮凝劑并確定了其使用條件。Al2(SO4)3作為發(fā)酵液的絮凝劑其最適pH為6，在25～35℃均可適用，對(duì)后續(xù)目標(biāo)小分子產(chǎn)物的提取影響不大，未增加提取物中金屬鋁的殘留量，發(fā)酵液中蛋白含量在250 μg/mL以下Al2(SO4)3用量約為100 μg/L，蛋白含量在250～400 μg/mL 時(shí) Al2(SO4)3用量約為150 μg/L，蛋白含量在400～950 μg/mL時(shí) Al2(SO4)3用量約為200 μg/L，蛋白含量在950 ～1 440 μg/mL 時(shí) Al2(SO4)3用量約為250 μg/L;與超濾膜法耦合，可高效快速進(jìn)行固液分離，濾液澄清度好、蛋白和多糖去除率高，并具有廣譜性，適用于大部分海洋細(xì)菌發(fā)酵液的預(yù)處理。

［1］ Mariadhas V A，Veeramuthu D，Savarimuthu I.Antibacterial and antifungal activities of polyketide metabolite from marine Streptomyces sp.AP-123 and its cytotoxic effect［J］.Chemosphere，2013，90(2):479-487.

［2］ Belfort G，Davis R H，Zydney A L.The behavior of suspensions and macromolecular solutions in cross-flow microfilm tration［J］.Journal of Membrane Science，1994，96(1-2):1-58.

［3］ Nobble R D，Stern S A.Membrane Separation Technology-Principles and Applications［M］.Amsterdam:Elsevier Science，1995:353-413.

［4］ 張一，杜連祥.萬古霉素發(fā)酵液凝聚與絮凝研究［J］.中國抗生素雜志，2007，32(5):291-294.

［5］ 沈金玉，熊訓(xùn)浩，劉元帥.絮凝與膜超濾耦合預(yù)處理谷氨酰胺發(fā)酵液［J］.精細(xì)化工，2002，19(11):675-677.

［6］ 畢喜婧，張建安，劉德華.甘油發(fā)酵液的絮凝除菌研究［J］.精細(xì)化工，2002，19(7):394-397.

［7］ 安志強(qiáng)，孫新順，喬文慶.考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定青霉素發(fā)酵液中可溶性蛋白質(zhì)含量［J］.分析與測(cè)試，2010，33(9):60-61.

［8］ 孫小丁，姜守剛，楊麗新.DNS法測(cè)定谷氨酸發(fā)酵過程中總糖的研究［J］.發(fā)酵科技通訊，2009，38(3):22-25.

［9］ 趙彥修，張露茜.赤霉素發(fā)酵液的絮凝預(yù)處理研究［J］.微生物學(xué)通報(bào)，1994，21(1):3-5.

［10］ 喻利娟，史玉坤，鉻天青S分光光度法測(cè)定食品中鋁的改進(jìn)［J］.中國公共衛(wèi)生，2001，17(9):848.