任曉鏷，李明楊，任少東，王群霞

1(塔里木大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾，843300)

2(新疆南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾，843300)

3(新疆阿拉爾質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測檢驗(yàn)所，新疆阿拉爾，843300)

細(xì)菌生物膜是指由細(xì)菌本身分泌的多聚基質(zhì)包裹、能黏附于某種有生命或者無生命固體表面的一種有結(jié)構(gòu)的群體，這是一種保護(hù)性的生長模式，它使細(xì)菌能夠在惡劣環(huán)境下存活［1］。所有的微生物均能夠形成生物膜［2］。細(xì)菌生物膜的形成是一個極為復(fù)雜的過程，受到外界各種因素的影響。不同的微生物，不同的因素均對生物膜的形成有重要影響。李延榮等［3］曾對金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響因素進(jìn)行過探索，表明金葡菌生物膜的形成存在不依賴于細(xì)菌數(shù)量的機(jī)制，NaCl及葡萄糖能夠在不影響細(xì)菌生長的條件下促進(jìn)其生物膜的形成。任曉鏷等［4］曾經(jīng)對表皮葡萄球菌ATCC 35984生物膜的形成有過研究，其結(jié)果顯示NaCl、高于0.2%的Ca2+以及8%及以上濃度的乳糖均對表葡菌生物膜的形成有明顯的抑制作用。李靜等［5］對糞腸球菌生物膜形成及其影響因素進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)時間為36 h，培養(yǎng)溫度為37℃，生物膜引導(dǎo)材料為乳膠時生物膜內(nèi)活菌數(shù)最多。真菌也能夠形成生物膜使其更適應(yīng)于環(huán)境。任曉萍等［6］對真菌生物膜形成的影響因素進(jìn)行了綜述，指出碳源、唾液、氧氣、酸堿、溫度及真菌種類均對其生物膜的形成影響巨大。長久以來，國內(nèi)外研究人員對病原微生物生物膜形成的影響因素探討較多，而對于有益生物膜的研究較少。Morikawa［7］曾對枯草芽孢桿菌有益生物膜對人類的貢獻(xiàn)進(jìn)行了綜述，他指出有益生物膜在作為生防試劑、生物反應(yīng)器及生物修復(fù)等方面起著重要作用。吳迪等［8］將固定化微生物生物膜技術(shù)應(yīng)用于處理農(nóng)村生活污水，較大程度地除去了污水中的有機(jī)物質(zhì)，使污水處理與利用結(jié)合得更加緊密。張正等［9］則是將微生物生物膜應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，他指出依靠富集有益微生物所形成的生物膜，通過微生物的新陳代謝作用實(shí)現(xiàn)對養(yǎng)殖廢水中有害物質(zhì)的降解和去除，進(jìn)而達(dá)到水質(zhì)凈化的目的。乳酸菌作為公認(rèn)安全細(xì)菌，其胞外代謝產(chǎn)物均為公認(rèn)安全，因此該類細(xì)菌所形成的生物膜有著巨大的開發(fā)研究潛力，深入研究并開發(fā)利用其特性成為必然趨勢。同其他微生物一樣，乳酸菌生物膜的形成也受到各種外界環(huán)境因素的影響。植物乳桿菌是一種常見于乳制品、肉類及蔬菜發(fā)酵制品中的乳酸菌，與人類的關(guān)系極為密切，對腸道微生物有重要影響，能夠通過胃并定植于人體腸道發(fā)揮有益作用［10］。無論在食品發(fā)酵、工業(yè)乳酸發(fā)酵，還是醫(yī)療保健等領(lǐng)域，都有著極為廣泛的應(yīng)用。本文旨在探索1株分離自新疆傳統(tǒng)乳制品——酸奶疙瘩并且不能形成生物膜的植物乳桿菌，尋找外界環(huán)境因素中是否存在能夠誘導(dǎo)其生物膜形成的條件，使乳酸菌的有益生物膜更廣泛地應(yīng)用于食品領(lǐng)域。

1 材料方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

生物膜形成強(qiáng)陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株——表皮葡萄球菌ATCC 35984，生物膜陰性乳酸菌——植物乳桿菌10#。

1.1.2 儀器及試劑

Absorbance Microplate Reader(Bilog，ELx808)，96孔板(Labphil Biotechnology)，移液器(Eppendorf AG)，MRS肉湯培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限公司)，葡萄糖、NaCl、CaCl2、MgCl2、乳酸、檸檬酸、蘋果酸、H3PO4、麥芽糊精及明膠等均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 微量板半定量法檢測細(xì)菌生物膜的形成

根據(jù)Christensen等的方法［11］并略做改動。按1∶100的接種比例將過夜培養(yǎng)的菌液30 μL，接種至3 mL培養(yǎng)基中，振蕩搖勻后，吸取200 μL至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每株接種5孔;剩余3孔為對應(yīng)空白對照(等體積的相應(yīng)空白液體培養(yǎng)基);同時每一培養(yǎng)板中設(shè)陽性對照(ATCC 35984)。37℃恒溫靜置培養(yǎng)48 h后，取出培養(yǎng)板用Microplate Reader測定其生長濁度OD590值，然后輕輕拍出培養(yǎng)液，無菌水洗板4次，每次振搖30下左右，以洗去未黏附細(xì)菌。56℃烘干固定1 h，50 μL 0.5%結(jié)晶紫染色5 min，自來水沖洗除去多余染液，37℃晾干，再用Microplate Reader測定其生物膜形成OD490值。所有生物膜形成檢測實(shí)驗(yàn)均在不同時間重復(fù)3次。

1.1.4 不同理化因素對植物乳桿菌生物膜形成的誘導(dǎo)

1.1.4.1 不同接種量

按不同的接種比例(1∶1、1∶5、1∶10、1∶50、1∶100、1∶200、1∶300、1∶400、1∶500、1∶1 000)將培養(yǎng)過夜的細(xì)菌母液接種至3 mL液體培養(yǎng)基中，按照1.1.3所述檢測細(xì)菌生物膜的形成。

1.1.4.2 不同培養(yǎng)溫度

按1.1.3所述將上樣好的96孔板分別置于不同的溫度(20、28、37、42 ℃)靜置培養(yǎng)48 h，然后再檢測其生物膜的形成。

1.1.4.3 不同培養(yǎng)時間

按1.1.3所述將上樣好的96孔板置于37℃條件下分別培養(yǎng)不同的時間(8、16、24、48、72 h)，然后檢測其生物膜的形成。

1.1.4.4 不同濃度葡萄糖

在細(xì)胞培養(yǎng)板中分別加入以含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%)葡萄糖的液體培養(yǎng)基200 μL，按照1.1.3所述檢測細(xì)菌生物膜的形成。

1.1.4.5 不同濃度NaCl

在細(xì)胞培養(yǎng)板中分別加入以含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%)NaCl的液體培養(yǎng)基200 μL，按照1.1.3所述檢測細(xì)菌生物膜的形成。

1.1.4.6 不同pH值

按1.1.3所述分別將液體培養(yǎng)基調(diào)為不同的pH(1.8、2.8、3.8、4.8、5.8、6.8、7.8、8.8、9.8、10.8)，再檢測其生物膜的形成。

1.1.4.7 不同濃度Ca2+和Mg2+

在細(xì)胞培養(yǎng)板中分別加入以含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0、0.5%、1.0%、1.5%)Ca2+與 Mg2+的液體培養(yǎng)基200 μL，按照1.1.3所述檢測細(xì)菌生物膜的形成。

1.1.5 不同食品添加劑對植物乳桿菌生物膜形成的誘導(dǎo)

1.1.5.1 不同濃度乳酸

在細(xì)胞培養(yǎng)板中分別加入以含不同體積分?jǐn)?shù)(0、0.2% 、0.4% 、0.8% 、1.2% 、1.6% 、2.0% 、3.0%)乳酸的液體培養(yǎng)基200 μL，按照1.1.3所述檢測細(xì)菌生物膜的形成。

1.1.5.2 不同濃度檸檬酸

在細(xì)胞培養(yǎng)板中分別加入以含不同體積分?jǐn)?shù)(0、0.2% 、0.4% 、0.8% 、1.2% 、1.6% 、2.0% 、3.0%)檸檬酸的液體培養(yǎng)基200 μL，按照1.1.3所述檢測細(xì)菌生物膜的形成。

1.1.5.3 不同濃度H3PO4

在細(xì)胞培養(yǎng)板中分別加入以含不同體積分?jǐn)?shù)(0、0.2% 、0.4% 、0.8% 、1.2% 、1.6% 、2.0% 、3.0%)磷酸的液體培養(yǎng)基200 μL，按照1.1.3所述檢測細(xì)菌生物膜的形成。

1.1.5.4 不同濃度麥芽糊精

在細(xì)胞培養(yǎng)板中分別加入以含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0、2.0%、5.0%、8.0%、12.0%、15.0%、18.0%)麥芽糊精的液體培養(yǎng)基稀釋的菌液200 μL，按1.1.3所述檢測生物膜形成。

1.1.5.5 不同濃度明膠

在細(xì)胞培養(yǎng)板中分別加入以含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%)明膠的液體培養(yǎng)基稀釋的菌液200 μL，按1.1.3所述檢測生物膜形成。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同理化因素誘導(dǎo)植物乳桿菌生物膜的形成

從圖1可以看出，不同的理化條件對植物乳桿菌的生長影響各不相同，并且對該細(xì)菌生物膜形成的誘導(dǎo)情況也各異。細(xì)菌母液接種量在1∶1～1∶1 000變化時，細(xì)菌的生長情況變化不大，各比例的接種量也對其生物膜的形成無明顯誘導(dǎo)作用(如圖1a);該細(xì)菌在所選擇4個溫度梯度條件下，細(xì)菌的生長及其生物膜均無明顯變化(如圖1b);細(xì)菌培養(yǎng)時間的縮短及延長對其生長及生物膜的形成無明顯影響(如圖1c);葡萄糖的添加能夠顯著提高細(xì)菌的生長量(P＜0.05)，并且隨著濃度的增高呈增高趨勢，尤其當(dāng)葡萄糖濃度達(dá)到6.0%及以上時，相對于2.0%濃度其生長量顯著增高(P＜0.05)，而葡萄糖的加入對細(xì)菌生物膜的形成卻無影響(如圖1d);8%及以上的NaCl能夠顯著抑制該細(xì)菌的生長(P＜0.05)，而在NaCl濃度低于6%時，對生長無明顯影響。但是，當(dāng)NaCl濃度在6%時，能夠顯著誘導(dǎo)植物乳桿菌形成強(qiáng)陽性生物膜(P＜0.05)，其他各濃度NaCl均無此作用(如圖1e)。不同pH對細(xì)菌的生長及對生物膜形成的誘導(dǎo)作用也不相同，當(dāng)初始培養(yǎng)液的pH在4.8～8.8之間時，細(xì)菌的生長基本未受到明顯影響。同時，pH為4.8和5.8時，具有誘導(dǎo)植物乳桿菌形成弱陽性生物膜的作用(如圖1f)。在所選濃度范圍內(nèi)，Ca2+和Mg2+均對細(xì)菌的生長和生物膜的形成無明顯影響(如圖1g)。

2.2 不同食品添加劑誘導(dǎo)植物乳桿菌生物膜的形成

從圖2可以看出，不同的食品添加劑對植物乳桿菌的生長及對其生物膜的誘導(dǎo)方面各不相同。低濃度的乳酸(0.2%)的加入即可顯著抑制細(xì)菌的生長(P＜0.05)，對其生物膜也無任何誘導(dǎo)形成的作用(如圖2a);而其他2種食品添加酸——檸檬酸和H3PO4，在較低濃度條件下能夠?qū)?xì)菌的生物膜起到一定的誘導(dǎo)作用。當(dāng)檸檬酸濃度為0.2%～0.8%時，細(xì)菌能夠形成弱陽性的生物膜(如圖2b);而H3PO4誘導(dǎo)其形成弱陽性生物膜的范圍為0.2%～0.4%(如圖2c)。經(jīng)t檢驗(yàn)分析，2種有機(jī)酸對細(xì)菌生物膜形成的誘導(dǎo)作用存在一定差異，0.2%的檸檬酸能夠達(dá)到顯著水平(P＜0.05)，而0.2%濃度的H3PO4誘導(dǎo)生物膜形成的水平不顯著。當(dāng)2種酸濃度達(dá)到一定濃度時(高于1.2%)，對細(xì)菌的生長有顯著抑制作用(P＜0.05)。麥芽糊精對細(xì)菌的生長及生物膜的形成均無影響(如圖2d);而明膠卻能夠在不影響細(xì)菌生長的情況下誘導(dǎo)細(xì)菌形成弱陽性的生物膜(P＜0.05)(如圖2e)。

3 討論

圖1 不同的理化因素對植物乳桿菌生物膜形成的誘導(dǎo)Fig.1 Effects of different physical and chemical factors on biofilm formation by Lactobacillus plantarum

圖2 不同的食品添加劑對植物乳桿菌生物膜形成的誘導(dǎo)Fig.2 Effects of different food additives on biofilm formation by Lactobacillus plantarum

乳酸菌是一類能夠利用可發(fā)酵性糖類產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌總稱，它與人類的關(guān)系極為密切。乳酸菌代謝產(chǎn)物乳酸、胞外多糖及細(xì)菌素等廣泛應(yīng)用于食品及醫(yī)藥等領(lǐng)域，人類利用乳酸菌的歷史可以追溯到5 000多年前［12］。許多乳酸菌是人體胃腸道固有有益菌叢，起著改善腸道內(nèi)環(huán)境、抑制致病菌生長的作用，并且能夠維持胃腸道微生態(tài)平衡，提高機(jī)體免疫力等功能［13］。細(xì)菌生物膜通常作為常見致病菌耐藥性產(chǎn)生的主要原因之一，而人們往往忽略了生物膜對人類有益貢獻(xiàn)的另一方面。充分將細(xì)菌生物膜的特性利用以為人類作更大的貢獻(xiàn)成為一種必然趨勢。例如枯草芽孢桿菌生物膜已被用作生物反應(yīng)器、作為生防試劑及生物修復(fù)等方面;乳酸菌生物膜的應(yīng)用也開始嶄露頭角，Atsumu等［14］已將乳酸菌與酵母菌共生形成的混合生物膜應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，并指出該種混合生物膜對細(xì)胞固定化技術(shù)的發(fā)展有極大推進(jìn)作用。因此，深入探索誘導(dǎo)乳酸菌生物膜形成的各種外界環(huán)境條件，有助于進(jìn)一步開發(fā)利用乳酸菌生物膜。

本文研究了1株分離自新疆傳統(tǒng)乳制品——酸奶疙瘩中的植物乳桿菌，它是生物膜陰性乳酸菌，本研究探索了不同的外界環(huán)境條件對其生物膜形成的誘導(dǎo)。結(jié)果表明，接種量、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、葡萄糖、Ca2+、Mg2+等理化因素均對該植物乳桿菌生物膜的形成無誘導(dǎo)作用;而乳酸及麥芽糊精也對其生物膜的形成無影響。在理化因素中，6%NaCl能夠顯著誘導(dǎo)該細(xì)菌生物膜的形成(P＜0.05)，而其他各濃度的NaCl均無此誘導(dǎo)作用。這可能是因?yàn)?%NaCl能夠激活調(diào)控其生物膜形成的基因，進(jìn)而誘導(dǎo)生物膜的形成。NaCl的這種誘導(dǎo)作用早在2001年就被提出過，Knobloch等［15］曾指出，NaCl能夠抑制表皮葡萄球菌icaR基因(阻遏生物膜形成的基因)的表達(dá)，激活SigB和RsbU因子，進(jìn)而誘導(dǎo)生物膜的形成;Rode等［16］證明NaCl對金葡菌生物膜的形成具有顯著增強(qiáng)作用，這進(jìn)一步驗(yàn)證了NaCl特有的誘導(dǎo)作用。有學(xué)者［17］指出，pH值在微生物生物膜的形成過程中起著至關(guān)重要的作用。這個作用可能是通過影響電子轉(zhuǎn)移而達(dá)到對生物膜的影響的。適合于生物膜形成的pH范圍很窄，并且不同的微生物其范圍不同。在本研究中，當(dāng)pH為4.8～5.8時，植物乳桿菌能夠被誘導(dǎo)形成弱陽性的生物膜。同樣，當(dāng)加入食品添加酸類的濃度達(dá)到0.4%時，培養(yǎng)液的pH約為5.6，弱陽性的生物膜也被誘導(dǎo)形成。這兩者前后呼應(yīng)，說明在某個范圍的pH能夠起到誘導(dǎo)乳酸菌形成弱陽性生物膜的作用。明膠是水溶性蛋白質(zhì)混合物，是一種無脂肪的高蛋白且不含膽固醇的天然營養(yǎng)型食品增稠劑，其主要組成為氨基酸組成相同而分子質(zhì)量分布很寬的多肽分子混合物，組成明膠的蛋白質(zhì)中含有18種氨基酸，蛋白質(zhì)的含量高達(dá)82%以上，另外還含有16%的水和無機(jī)鹽。國內(nèi)外有關(guān)明膠與微生物生物膜的研究多是利用生物膜作為生物反應(yīng)器進(jìn)行明膠的水解，關(guān)于采用明膠作為微生物生物膜形成的誘導(dǎo)劑尚無研究。從本研究結(jié)果可以看出，明膠能夠誘導(dǎo)植物乳桿菌形成弱陽性的生物膜，這可能是因?yàn)槊髂z具有較好的增稠效果，能夠粘連細(xì)菌胞外多糖而發(fā)生聚集，進(jìn)而形成生物膜。

從以上結(jié)果可以看出，各種不同的外界環(huán)境條件對細(xì)菌生物膜形成的誘導(dǎo)作用各不相同，在本研究中6%的NaCl能夠誘導(dǎo)植物乳桿菌形成強(qiáng)陽性的生物膜，酸環(huán)境以及明膠也能夠誘導(dǎo)該細(xì)菌形成弱陽性的生物膜，但是可能對其他種類的微生物，誘導(dǎo)其形成生物膜的因素又會發(fā)生改變，因?yàn)樯锬ば纬傻挠绊懸蛩乇姸嗲覐?fù)雜。無論是哪種因素對其生物膜的誘導(dǎo)作用，其誘導(dǎo)機(jī)理均為推測，具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步探索和研究。

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