李武，傅莉華，鄺穎詩，盧倩，楊瑞麗

（廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州510642）

天麻（Gastrodia elata Bl.）是蘭科天麻屬多年生草本植物天麻的干燥根莖，主產(chǎn)于我國云南、四川及貴州等地，是一種重要的藥食兩用植物。研究表明天麻的主要有效成分為天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛等多種成分[1]，天麻具有抗驚厥、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛及抗炎等生物學(xué)功能[2-3]。隨著社會(huì)的發(fā)展，人們工作生活的壓力越來越大，隨之產(chǎn)生的焦慮、失眠等癥狀不斷困擾著人們的正常生活[4-5]。在民間，作為一種重要的食材，自古就有將天麻與雞、魚等一同食用用于滋養(yǎng)安神的做法。傳統(tǒng)的天麻加工方法是采用將鮮天麻煮或蒸后再烘干，然后切片。這種傳統(tǒng)的加工方法有容易損失有效成分、有效成分不易浸出、質(zhì)量指標(biāo)難以控制等缺點(diǎn)，從目前的加工和食用方法來看，天麻的生物利用率還不高。超微粉碎技術(shù)是一門新興的物料加工技術(shù)，該技術(shù)在天然食物資源開發(fā)中的應(yīng)用是食品加工業(yè)的一種新嘗試。超微粉碎技術(shù)在制粉技術(shù)中具有很大的優(yōu)勢，不僅在宏觀上減小顆粒粒徑，而且隨著粒徑細(xì)化的量變，會(huì)導(dǎo)致比表面積和孔隙率增加，使粉體具有良好的分散性和吸附性等，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[6-7]。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究天麻超微粉在體內(nèi)的吸收情況及對于改善睡眠作用的影響，為天麻微粉的制劑開發(fā)與應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠，體重220 g～250 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。許可證號：SCXK（粵）2008-0002；清潔級昆明種小鼠，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2013-0034，等級：SPF級，飼養(yǎng)環(huán)境：室溫為20.0℃～24.8℃，相對濕度為46.8%～50.4%RH；天麻素對照品（中國食品藥品檢定研究院，編號62.110807）；乙腈為HPLC級；磷酸為分析純；無水乙醇（分析純）；巴比妥鈉、戊巴比妥鈉廣州健陽生物科技有限公司；天麻（Gastrodia elata Bl.）超微粉(D 5023.77 μm)由湯臣倍健股份有限公司提供，每日成人推薦服用量為2.4 g/人·d，超微粉的粒徑分布圖和掃描電鏡照片見圖 1。微粉的平均粒徑 31.97 μm，D50、D90 分別為23.77 μm、51.22 μm。

由圖1可看出超微粉粉體的粒徑分布曲線呈正態(tài)分布，說明粉體的均勻性，分散性較好。

1.2 天麻超微粉在大鼠體內(nèi)吸收情況

1.2.1 高效液相色譜條件與標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

利用中國藥典1部等報(bào)道的HPLC法檢測天麻素[8]，具體條件如下：安捷倫-C18色譜柱（4.6mm×250mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸溶液（3∶97）；流速為1.0 mL/min；檢測波長為220 nm；柱溫：25℃。精密稱取天麻素標(biāo)準(zhǔn)品5 mg溶解于10 mL乙腈-0.05%磷酸溶液（3∶97），并配制成濃度為 500 μg/mL 的儲備液。精密吸取儲備液，分別稀釋成 0.5、1、5、10、25、50 μg/mL，用孔徑0.22 μm濾膜過濾后，置于樣品瓶中，-20℃冰箱保存待用。按照上述色譜條件進(jìn)行HPLC測定，作峰面積對濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出直線回歸方程。

圖1 天麻超微粉的粒徑分布圖（A）和掃描電鏡照片（×1000）（B）Fig.1 The size distribution（A）and scanning electron micrograph（B）of Gastrodia elata Bl.ultrafine powder

1.2.2 HPLC法測定天麻超微粉中天麻素的含量

按照張煒等[9]報(bào)道方法提取天麻素，具體方法如下：精密稱取天麻超微粉0.1 g，加入10 mL水，靜置過夜，次日超聲30 min，3500 r/min離心10 min，取上清液于35℃減壓濃縮蒸干，加流動(dòng)相1 mL溶解并定容，過0.45 μm微孔濾膜后進(jìn)樣。

1.2.3 天麻超微粉中天麻素的生物利用度

取健康雄性SD大鼠9只，實(shí)驗(yàn)前禁食24 h，自由飲水。各組大鼠分別尾靜脈注射天麻素（25 mg/kg）、灌胃天麻超微粉（4 g/kg）。分別于灌胃前和后5、15、30、50、70、90、120、180min 斷尾取血 0.5mL，肝素抗凝，4℃、 3000 r/min離心10 min分離血漿，20℃保存?zhèn)溆?。按照J(rèn)u XH等報(bào)道的方法進(jìn)行血漿前處理[10]，精密吸取血漿150 μL，加入乙醇0.5 mL，再渦旋振蕩1 min后于 12000 r/min離心10 min除蛋白，取上清液，然后在室溫下氮?dú)獯蹈?。分別加500 μL流動(dòng)相溶解，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)樣。

1.3 天麻超微粉改善睡眠功能研究

1.3.1 動(dòng)物分組與處理

參照《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003版）中方法[11]。將健康雌性小鼠，體重 18 g～22 g，120 只，分3批用于試驗(yàn)，第1批動(dòng)物用于直接睡眠實(shí)驗(yàn)和延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)，第2批動(dòng)物用于戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)，第3批動(dòng)物用于巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)。每批動(dòng)物按體重隨機(jī)分為低、中、高劑量組和1個(gè)陰性對照組，每組10只動(dòng)物。低、中、高劑量組分別為40、400和 1200 mg/kg·BW（分別相當(dāng)于受試樣品推薦日攝入量的 1、10、30倍）。按 0.2 mL/10 g·BW經(jīng)口灌胃，陰性對照組給予等量溶劑，每日灌胃1次，連續(xù)30 d。

1.3.2 測定指標(biāo)與方法

按照衛(wèi)生部《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003年版）方法進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)部分：延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)和巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)。

1.3.2.1 直接睡眠實(shí)驗(yàn)

觀察受試組動(dòng)物給予受試樣品后，陰性對照組給予同體積溶劑后，是否出現(xiàn)睡眠現(xiàn)象。睡眠以翻正反射消失為指標(biāo)。如超過30 s～60 s不能翻正者，既認(rèn)為翻正反射消失，進(jìn)入睡眠。翻正反射恢復(fù)即為覺醒，翻正反射消失至恢復(fù)這段時(shí)間為動(dòng)物睡眠時(shí)間。記錄對照組與受試樣品組入睡動(dòng)物數(shù)及睡眠時(shí)間。

1.3.2.2 延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)

在直接睡眠實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行，如直接睡眠實(shí)驗(yàn)為陰性，則進(jìn)行延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)。做正式實(shí)驗(yàn)前先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定使動(dòng)物100%入睡，但又不使睡眠時(shí)間過長的戊巴比妥鈉劑量，用此劑量做正式實(shí)驗(yàn)（本實(shí)驗(yàn)劑量為：32 mg/kg·BW）。動(dòng)物末次給予溶劑及不同濃度受試樣品后，出現(xiàn)峰作用前10 min～15 min，給各組動(dòng)物腹腔注射戊巴比妥鈉，以翻正反射消失為指標(biāo)，觀察受試樣品能否延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間。

1.3.2.3 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)

做正式實(shí)驗(yàn)前先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定戊巴比妥鈉閾下催眠劑量，即80%～90%小鼠翻正反射不消失的戊巴比妥鈉最大閾下劑量。動(dòng)物末次給予溶劑及不同濃度受試樣品后，出現(xiàn)峰作用前10 min～15 min，給各組動(dòng)物腹腔注射戊巴比妥鈉最大閾下催眠劑量（本實(shí)驗(yàn)劑量為：20 mg/kg·BW），記錄30 min內(nèi)入睡動(dòng)物數(shù)（翻正反射消失達(dá)1 min以上者）。

1.3.2.4 巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)

做正式實(shí)驗(yàn)前先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定使動(dòng)物100%入睡，但又不使睡眠時(shí)間過長的巴比妥鈉的劑量，用此劑量正式實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物末次給予溶劑及不同濃度受試樣品10 min～20 min后，給各組動(dòng)物腹腔注射巴比妥鈉（本實(shí)驗(yàn)劑量為：295 mg/kg·BW），以翻正反射消失為指標(biāo)，觀察受試樣品對巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。睡眠時(shí)間為計(jì)量資料，數(shù)據(jù)采用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。入睡動(dòng)物數(shù)為計(jì)數(shù)資料，采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 天麻超微粉在大鼠體內(nèi)吸收情況

2.1.1 天麻素的色譜圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線

天麻素在220 nm處有最大吸收峰，其保留時(shí)間為5.91 min，在血漿樣品中，目標(biāo)峰也與其他雜峰分離良好。在規(guī)定的色譜條件下，作天麻素濃度X-相應(yīng)峰面積Y的線性回歸方程，其回歸方程為Y= 18781X+ 2435.7，R2= 9999（圖 2）。

圖2 天麻素標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖（A）及標(biāo)準(zhǔn)曲線（B）Fig.2 HPLC chromatogram of gastrodin standards（A）and standard curve of gastrodin（B）

2.1.2 天麻超微粉中天麻素的含量

在給定的色譜條件下測定天麻超微粉樣品，測定出的天麻素峰面積積分值后，按對應(yīng)的線性方程計(jì)算其含量，分別測定3次，結(jié)果見表1，本實(shí)驗(yàn)所用受試物天麻超微粉中天麻素的含量0.24%。

表1 天麻超微粉中天麻素含量測定結(jié)果Table 1 The content of gastrodin in the Gastrodia elata Bl.ultrafine powder %

2.1.3 天麻超微粉中天麻素的生物利用度

天麻素在220 nm處有最大吸收峰，其保留時(shí)間為5.91 min，在血漿樣品中，目標(biāo)峰也與其他雜峰分離良好。高效液相色譜儀中測得的各時(shí)間點(diǎn)峰面積比值代入到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，計(jì)算大鼠血漿中天麻素濃度。大鼠血漿中天麻素濃度－時(shí)間曲線見圖3，天麻超微粉的絕對生物利用度達(dá)60.77%。

圖3 大鼠靜脈注射天麻素、灌胃天麻超微粉后血漿中平均天麻素濃度－時(shí)間曲線Fig.3 Mean plasma concentration-time curve of gastrodin i.v.treated group and the Gastrodia elata Bl.ultrafine powder i.g.treated group in rats

2.2 天麻超微粉改善睡眠功能

2.2.1 天麻超微粉對小鼠體重的影響

實(shí)驗(yàn)開始前，稱量實(shí)驗(yàn)小鼠初始體重，并根據(jù)小鼠體重隨機(jī)分組。灌胃結(jié)束時(shí)，稱量實(shí)驗(yàn)小鼠終體重，并對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，見表2。

表2 天麻超微粉對小鼠體重的影響Table 2 The effect data of Gastrodia elata Bl.ultrafine powder on body weight of mice

從表2可以看出，天麻超微粉低、中、高劑量組的實(shí)驗(yàn)小鼠初始體重和終體重與空白對照組比較差異均不顯著（P＞0.05），表明天麻超微粉對小鼠的體重增長無影響。

2.2.2 天麻超微粉直接睡眠實(shí)驗(yàn)

各試驗(yàn)組給予受試樣品，陰性對照組給予同體積溶劑后，經(jīng)觀察30 min，翻正反射存在，未出現(xiàn)睡眠現(xiàn)象。

2.2.3 天麻超微粉對小鼠戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間的影響

各組動(dòng)物睡眠時(shí)間經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，sig=0.175＞0.05，所以，接受原假設(shè)，認(rèn)為因素是方差相等的，經(jīng)方差分析，其組間差異沒有達(dá)到顯著性水平（P＞0.05，表3）。說明該受試樣品沒有顯著延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間的作用。

表3 天麻超微粉對小鼠戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間的影響Table 3 Effects of tested drug on sleep time induced by pentobarbital sodium in mice

2.2.4 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)

低、中、高劑量組動(dòng)物入睡率與陰性對照組相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表4）。說明該受試樣品可以增加戊巴比妥鈉閾下劑量動(dòng)物入睡率。

表4 天麻超微粉對小鼠戊巴比妥鈉閾下劑量催眠作用的影響Table 4 Effects of test drug with sub-threshold dose of sodium pentobarbital on sleeping rate of mice

2.2.5 巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)

低、中、高劑量組動(dòng)物巴比妥鈉睡眠潛伏期與陰性對照組相比，差異具有顯著性（P＜0.05，表5）。說明該受試樣品可使睡眠潛伏期縮短，受試樣品與巴比妥鈉有協(xié)同作用。

表5 天麻超微粉對小鼠巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響Table 5 Effect of tested drug with sodium barbital on the sleep incubation period of mice

3 討論與結(jié)論

天麻中主要活性成分為天麻素，本實(shí)驗(yàn)所用受試物天麻超微粉中含有天麻素含量0.24%，天麻素的絕對生物利用度達(dá)60.77%，較接近直接灌胃天麻素的生物利用度[12]，說明微粉化處理有利于天麻有效成分的消化吸收。本研究結(jié)果表明，經(jīng)口灌胃給予小鼠不同的受試物30 d，空白對照組、天麻超微粉三個(gè)劑量組小鼠在60 min內(nèi)，均未發(fā)現(xiàn)有直接睡眠現(xiàn)象，并且該天麻超微粉對小鼠的體重增加無明顯影響。40、400和 1200 mg/kg·BW天麻均具有協(xié)同戊巴比妥鈉閾下劑量催眠作用，能縮短巴比妥鈉睡眠潛伏期，提示該天麻與戊巴比妥鈉和巴比妥鈉有明顯的協(xié)同作用，根據(jù)衛(wèi)生部《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003年版）中的判定標(biāo)準(zhǔn)，該天麻超微粉具有改善睡眠功能作用。此結(jié)果與齊麗娟等[13]的研究結(jié)果相似，但本實(shí)驗(yàn)中天麻粉的灌胃劑量顯著低于上述報(bào)道中普通粉的灌胃劑量（約為1/2劑量），原因可能是超微粉化能增加比表面積和孔隙率，進(jìn)而提高有效成分在體內(nèi)的吸收率。胥佳等發(fā)現(xiàn)超微粉碎處理有利于葡萄籽中原花青素的釋放[14]，劉素穩(wěn)等研究發(fā)現(xiàn)超微粉碎能顯著提高鮑菇粉的比表面積和多糖溶出率[15]，這些體外實(shí)驗(yàn)也證明超微粉化能提高有效成分的溶出和釋放。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明微粉化能夠提高天麻粉中天麻素的生物利用度，進(jìn)而提高其改善睡眠功能的效果。本研究為天麻超微粉功能食品的制劑開發(fā)與應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

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