西安市中心醫(yī)院燒傷整形外科 （西安710003） 郝 劍 劉 賓 汪 陽 陶 諫 田 萍

負壓 創(chuàng) 面 治 療 技 術(shù) （Negative pressure wound therapy，NPWT）是一種促進創(chuàng)面愈合的醫(yī)療技術(shù)。該技術(shù)是將吸引裝置與特殊的傷口敷料連接后，使傷口保持在負壓狀態(tài)，可以改善創(chuàng)面微循環(huán)，促進創(chuàng)面肉芽生長，減少細菌定植和繁殖，保持傷口環(huán)境濕潤，從而達到治療創(chuàng)面的目的。封閉式負壓吸引技術(shù)可分為持續(xù)性負壓吸引、間斷式負壓吸引以及變壓式負壓吸引，而目前臨床上對于應(yīng)用該技術(shù)治療慢性創(chuàng)面時負壓模式的選擇沒有一個統(tǒng)一的規(guī)范與標準。我們通過初步的實驗，探索應(yīng)用封閉式負壓引流技術(shù)治療慢性創(chuàng)面時的較為合理的負壓治療模式，為該技術(shù)在臨床創(chuàng)面治療領(lǐng)域更廣泛的應(yīng)用打下良好的理論基礎(chǔ)。

材料與方法

1 材 料 封閉式負壓吸引裝置及敷料（武漢維斯第公司）。構(gòu)建兔耳慢性創(chuàng)面模型：健康CL級新西蘭大耳白兔24只，48～60月齡（老齡兔），體重3．9～5．0kg。30g／L戊巴比妥鈉1．5ml／kg耳緣靜脈麻醉，多普勒血流儀測定兔耳背側(cè)動靜脈走向及分布，從根部向遠端分段結(jié)扎兔耳中央動脈及頭側(cè)動靜脈，結(jié)扎后血管呈紫黑色，在耳根部切開皮膚，切斷中央動脈及頭側(cè)動靜脈，保留尾側(cè)靜脈及周圍皮膚約0．5cm，將軟骨膜掀開并向兩側(cè)分離約0．5cm，去除游離的軟骨膜，縫合皮膚。用手術(shù)刀在耳腹側(cè)制5cm×2cm的長方形創(chuàng)面，刮除軟骨膜，暴露軟骨。以明膠海棉薄片蘸取0．9%生理鹽水覆于每個創(chuàng)面 外層覆蓋無菌密封薄膜。為維持缺血狀態(tài)，于術(shù)后3d、6d、9d和12d在兔耳根部多次行環(huán)扎手術(shù)，直至軟骨表面形成穩(wěn)定創(chuàng)面。

2 方 法

2．1 分組：將入選兔耳慢性創(chuàng)面模型隨機分為三組，每組8只16例創(chuàng)面，第一組為持續(xù)性負壓吸引組，第二組為間斷性負壓吸引組，第三組為變壓性負壓吸引組。創(chuàng)面及創(chuàng)周用生理鹽水和氯己定（1∶1000）清洗后，按創(chuàng)面大小修剪多孔藻酸鹽敷料，置入創(chuàng)面至創(chuàng)緣，引流管由創(chuàng)緣直接引出，透明貼膜封閉整個創(chuàng)面。將引流管通過連接管連于負壓終端，持續(xù)負壓吸引組負壓參數(shù)120mmHg，間斷負壓吸引組負壓參數(shù)為0mmHg及120mmHg，變壓負壓吸引組負壓參數(shù)為10～120mmHg。在三種壓力治療模式下分別對兔耳慢性創(chuàng)面進負壓吸引治療。

2．2 創(chuàng)面大體觀察：將上述三治療組分別于負壓下處理24、48、72h后更換創(chuàng)面藻酸鹽敷料，觀察創(chuàng)面的滲出、異味以及肉芽組織生長情況。在治療前及每個治療時間點分別于創(chuàng)緣切取2mm×2mm×2mm大小的組織塊及創(chuàng)緣正常皮膚行后續(xù)組織學(xué)檢查。

2．3 創(chuàng)面收縮測量：分別于負壓持續(xù)處理24、48、72h測量各組創(chuàng)面的長度及寬度，計算創(chuàng)面收縮率［1］。

2．4 細胞周期測定：活檢組織生理鹽水清洗后，置于5ml Dispase液中，37℃，2h。分離表皮（刮除方法），加入0．1g／L的胰蛋白酶5ml，吹打3～5min，取上清。200目濾網(wǎng)過濾，取濾液，加入50ml／L小牛血清離心（1000r／min，10min）。棄上清，加入 DMEM 5ml，輕輕吹打后同法離心2次，去除小碎片。棄上清，加入PBS 1ml，輕輕吹打，調(diào)整細胞數(shù)至（1～2）×106。將細胞懸液加入2ml 4%酒精中固定，封口，4℃保存。固定的細胞懸液用PBS離心洗滌2次，調(diào)整細胞數(shù)至1×106，加入PI染液1ml，4℃冰箱避光染色30min，流式細胞儀測定分析細胞周期。

2．5 免疫組化SABC法檢測細胞核增殖抗原（PCNA）：參照Boster公司產(chǎn)品使用說明操作。15μm石蠟切片，二甲苯脫蠟，甲醇－30ml／L 過氧化氫，30min，PBS 清 洗 5min×3 次，50ml／L 兔 抗 血 清30min，PCNA單抗（1∶200）室溫過夜，PBS清洗5min×3次，羊抗兔血清（1∶200），室溫30min，SABC室溫下30min。PBS清洗5min×3次，DAB顯色，脫水、透明，封片，觀察。以0．01mol／L的PBS代替一抗作陰性對照。結(jié)果判斷：400倍光鏡下觀察記錄5個視野內(nèi)平均陽性細胞數(shù)。陽性細胞數(shù)低于5個計為（－），5～10個計為（＋），10個以上計為（?），大于半數(shù)計為（?）。

2．6 統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS11．0統(tǒng)計學(xué)軟件，組織學(xué)及免疫組化結(jié)果按等級資料分析；細胞周期測定值作成組t檢驗，方差不齊時作t檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 創(chuàng)面大體觀察結(jié)果 24h：持續(xù)負壓組、間斷負壓及變壓負壓三組均引流通暢、創(chuàng)面分泌物減少、創(chuàng)面出現(xiàn)收縮；48h：三組均引流通暢，創(chuàng)面分泌物減少，持續(xù)負壓組創(chuàng)面縮小無明顯變化，間斷及變壓兩組創(chuàng)面持續(xù)縮?。?2h：三組均引流通暢、其中變壓治療組肉芽組織鮮紅并均勻擴大；持續(xù)負壓吸引組肉芽組織散在，分布不均勻，間斷負壓治療組肉芽組織生長情況介于二者之間。

2 創(chuàng)面收縮率 經(jīng)過負壓吸引治療的各組創(chuàng)面均出現(xiàn)明顯收縮，其中持續(xù)負壓吸引組創(chuàng)面持續(xù)收縮72h，但創(chuàng)面面積縮小不明顯。間斷負壓吸引組和變壓負壓吸引組負壓治療開始后也出現(xiàn)明顯創(chuàng)面收縮，且隨治療時間延長創(chuàng)面面積出現(xiàn)逐漸縮小（附圖）。

3 細胞周期測定 正常皮膚組織細胞以G0／G1期為主，S期及G2＋M期細胞比例較小。治療后24h及48h，持續(xù)負壓吸引組S期及G2＋M期細胞均與創(chuàng)緣正常皮膚基本相同，統(tǒng)計學(xué)分析無顯著性差異（P＞0．05）；治療48h間斷負壓及變壓負壓吸引組S期及G2＋M期細胞出現(xiàn)增多（P＜0．05）；治療后72h，三組S期及G2＋M期細胞均較正常皮膚組明顯增多 （P＜0．05）。這表明：負壓治療的早期（24h之內(nèi)）創(chuàng)面未出現(xiàn)明顯的上皮細胞增生；間斷負壓和變壓治療較持續(xù)負壓能夠更早的誘導(dǎo)組織細胞增生，見表1。

附圖 三種負壓模式不同治療時間創(chuàng)面面積收縮率

表1 正常皮膚與不同負壓模式處理組創(chuàng)面細胞周期變化（±s）

表1 正常皮膚與不同負壓模式處理組創(chuàng)面細胞周期變化（±s）

24h 48h 72h細胞周期 正常皮膚80．23±8．34 77．41±8．47 76．27±7．89 S 7．58±3．58 8．08±3．43 8．12±3．28 7．41±3．26 7．62±3．48 14．18±4．27 15．67±5．19 15．31±4．79 16．97±5．14 17．36±5．09 G2＋M 1．24±1．16 1．91±1．12 1．90±1．09 1．37±1．03 1．95±1．04 4．59±2．36 4．86±2．29持續(xù)負壓 間斷負壓 變壓負壓G0／G191．18±8．03 90．01±8．24 89．98±8．17 91．22±8．35 90．43±8．37 81．23±7．65 79．47±8．54持續(xù)負壓 間斷負壓 變壓負壓 持續(xù)負壓 間斷負壓 變壓負壓4．46±1．99 5．52±2．18 6．37±1．96

治療24h三組S期及G2＋M期細胞與正常皮膚組比較無顯著差異（P＞0．05）；治療48h間斷負壓，變壓負壓兩組S期及G2＋M期細胞與正常皮膚組比較，有顯著性差異（P＜0．05）；持續(xù)負壓組S期及G2＋M期細胞與正常皮膚組比較，無顯著性差異（P＞0．05）；治療72h三組S期及G2＋M期細胞與正常皮膚組比較，有顯著性差異（P＜0．05）。

4 PCNA表達改變 正常皮膚組織中細胞核增殖抗原（PCNA）表達陽性細胞主要是皮膚基底細胞，表皮細胞、成纖維細胞及毛囊上皮細胞PCNA均為陰性。治療24h，持續(xù)負壓、間斷負壓及變壓負壓三組創(chuàng)面組織中皮膚基底細胞，表皮細胞、成纖維細胞及毛囊上皮細胞PCNA均為陰性，表明在負壓治療的早期（24h內(nèi)），創(chuàng)面沒有出現(xiàn)明顯的組織細胞增殖；治療48h，變壓負壓及間斷負壓治療組，成纖維細胞及毛囊上皮細胞PCNA出現(xiàn)陽性，持續(xù)負壓組為陰性；治療72h，變壓負壓及間斷負壓治療組，成纖維細胞及毛囊上皮細胞PCNA表達明顯增強，而成纖維細胞更為明顯；持續(xù)負壓治療組三種細胞PCNA表達均出現(xiàn)陽性，此結(jié)果提示間斷負壓及變壓負壓治療可能較早的誘發(fā)創(chuàng)面組織細胞的增殖，見表2。

治療24h：三負壓處理組中三類細胞PCNA表達水平與正常皮膚組比較，無顯著性差異（P＞0．05）；治療48h：間斷負壓與變壓負壓中成纖維與毛囊細胞PCNA表達水平與正常皮膚組比較，有顯著性差異（P＜0．05）；治療72h：持續(xù)負壓、間斷負壓、變壓負壓三組中成纖維與毛囊細胞PCNA表達水平與正常皮膚組比較，有顯著性差異（P＜0．05）。

表2 正常皮膚與不同負壓處理組創(chuàng)面PCNA表達水平（±s）

表2 正常皮膚與不同負壓處理組創(chuàng)面PCNA表達水平（±s）

24h 48h 72h分組 正常皮膚持續(xù)負壓 間斷負壓 變壓負壓基底細胞 ＋～? ／ ／ ／ ／ ／ －～＋ －～＋ －～＋ －～＋持續(xù)負壓 間斷負壓 變壓負壓 持續(xù)負壓 間斷負壓 變壓負壓成纖維細胞 — — — — — ＋～? ＋～? －＋～? ?～? ?～?毛囊上皮細胞 — — — — — ＋ ＋ ＋～? ＋～? ＋～?

討 論

作為近幾年來興起的一種促進創(chuàng)面愈合的技術(shù)，封閉式負壓吸引為慢性創(chuàng)面的處理及治療提供了一種良好的選擇［2，3］。封閉式負壓吸引技術(shù)為創(chuàng)面肉芽組織生長提供了一個相對封閉、潮濕及無菌的環(huán)境，它可促進創(chuàng)面的血液微循環(huán)及肉芽組織生長，降低換藥所帶來的創(chuàng)面疼痛。國內(nèi)外學(xué)者將負壓創(chuàng)面治療技術(shù)應(yīng)用于多種急、慢性創(chuàng)面的治療或促進移植皮膚、皮瓣的成活，均取得了良好的效果［4］。

目前，臨床上負壓吸引治療所用的壓力模式多為持續(xù)性恒定壓力，這種治療模式的優(yōu)點是簡單方便、易于推廣，在有中心負壓病房的臨床科室很容易開展。然而歐美負壓創(chuàng)傷治療學(xué)會的基礎(chǔ)理論研究顯示，在一定范圍的負壓下，間斷壓力或者變化壓力的吸引方法，更加符合創(chuàng)面修復(fù)的病理循環(huán)周期，有利于細胞的有絲分裂和蛋白合成以及各種組織再生和肉芽生長，加速創(chuàng)傷愈合過程［5］。因此我們將三種負壓模式作用于兔耳慢性創(chuàng)面模型，通過對各種壓力模式下不同時間創(chuàng)面大體外觀、收縮率、細胞周期及細胞核增殖抗原表達的測定與分析，探討間斷性負壓以及變壓性負壓這兩種不同負壓治療模式在臨床應(yīng)用的可行性。

通過對三種負壓模式處理后創(chuàng)面外觀的觀察發(fā)現(xiàn)：三種壓力模式在72h左右均可以達到誘導(dǎo)肉芽組織生長、通暢引流及促進創(chuàng)面收縮的治療效果。而間斷負壓以及變壓負壓在促進肉芽組織生長及創(chuàng)面收縮方面的效果更加明顯。持續(xù)負壓吸引可以立即誘發(fā)創(chuàng)面的收縮，且在整個治療的過程保持不變。間斷負壓以及變壓負壓在治療的開始也立刻出現(xiàn)創(chuàng)面的收縮，但與持續(xù)負壓吸引不同的是，這種收縮是逐漸增加的，也就是說，傷口面積在逐漸減。因此在治療72h后，我們可以發(fā)現(xiàn)間斷負壓及變壓負壓組的創(chuàng)面面積明顯較持續(xù)負壓組變小。這種差異的可能原因是由于間斷負壓及變壓負壓的按摩效果，刺激創(chuàng)面邊緣組織的細胞骨架重構(gòu)、導(dǎo)致信號Cascade及生長因子釋放，促進細胞的有絲分裂以及組織生長［6，7］。

通過應(yīng)用流式細胞儀測定各組樣本組織細胞DNA含量，計算出各期細胞所占比例，發(fā)現(xiàn)三種負壓模式處理創(chuàng)面在24hS期及G2＋M期細胞較正常皮膚均未明顯增多；48h間斷及變壓負壓治療組S期及G2＋M期細胞出現(xiàn)增多；72h三組創(chuàng)面S期及G2＋M期細胞均明顯增多；提示組織細胞增殖活躍，創(chuàng)面進入修復(fù)狀態(tài)在傳統(tǒng)的持續(xù)性負壓吸引治療中開始于治療后72h而通過改變負壓吸引模式為間斷性或變壓性，則有能將這一修復(fù)開始時間提前至治療開始后48h。

正常情況下，PCNA存在于部分皮膚基底細胞核內(nèi)，如出現(xiàn)在成纖維細胞或其他細胞內(nèi)，則表示組織細胞增殖活躍。本實驗發(fā)現(xiàn)，在治療后72h三種負壓治療模式中創(chuàng)面組織中皮膚毛囊上皮細胞及成纖維細胞PCNA均呈現(xiàn)高表達，均與對照組創(chuàng)緣周圍正常皮膚有顯著差異。治療48h間斷負壓及變壓負壓治療組創(chuàng)面組織中皮膚毛囊上皮細胞及成纖維細胞PCNA均呈現(xiàn)陽性表達，與對照組創(chuàng)緣周圍正常皮膚有顯著差異，而持續(xù)負壓吸引組則為弱陽性表達。在治療開始的24h三組創(chuàng)面PCNA均呈陰性。這一結(jié)果也與創(chuàng)面細胞周期實驗結(jié)論相符。

封閉式負壓吸引治療可改善創(chuàng)面的血液微循環(huán)并促進創(chuàng)面肉芽組織生長。相對傳統(tǒng)的持續(xù)負壓，間斷負壓及變壓負壓這兩種負壓吸引模式，能夠較早的誘導(dǎo)創(chuàng)面細胞增殖，促進肉芽組織生長及傷口收縮。因此，在封閉式負壓吸引技術(shù)治療慢性創(chuàng)面時，間斷負壓和變壓負壓這兩種模式可以作為治療中的優(yōu)先選擇。

［1］ Borgquist O，Ingemansson R，Malmsjo M．Micro－and macromechanical effects on the wound bed by negative pressure wound therapy using gauze and foam［J］．Ann Plast Surg，2010，64（6）：789－93．

［2］ Armstrong DG，Lavery LA．Negative pressure wound therapy after partial diabetic foot amputation：a multicentre，randomised controlled trial［J］．Lancet，2005，366：1704－1710．

［3］ Lavery LA，Boulton AJ，Niezgoda JA，et al．A comparison of diabetic foot ulcer outcomes using negative pressure wound therapy versus historical standard of care［J］．Int Wound J，2007，4：103－113．

［4］ Saraiya HA，Shah N．Use of indigenously made negativepressure wound therapy system for patients with diabetic foot［J］．Adv Skin Wound Care，2013，26（2）：74－7．

［5］ Borgquist O，Ingemansson R，Malmsjo M．The effect of intermittent and variable negative pressure wound therapy on wound edge microvascular blood flow［J］．Ostomy Wound Manage，2010，56（3）：60－7．

［6］ Borgquist O，Ingemansson R，Malmso M．Micro－and macromechanical effects on the wound bed by negative pressure wound therapy using gauze and foam［J］．Ann Plast Surg，2010，64（6）：789－93．

［7］ Saxena V，Hwang CW，Huang S，et al．Vacuum－assisted closure：microdeformations of wounds and cell proliferation［J］．Plast Reconstr Surg，2004，114（5）：1086－96．