李 晅，王冬梅，沈 剛，唐國華(上海市口腔病防治院口腔正畸科，上海 0000;上海交通大學(xué)機械與動力工程學(xué)院;上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔正畸科;上海市口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室;通訊作者，E-mail:tangg@graduate.hku.hk)

細(xì)胞凋亡(apoptosis)，是指有核細(xì)胞在體內(nèi)外因素觸發(fā)下，啟動自身內(nèi)部機制，通過激活內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶引起細(xì)胞的自然死亡。細(xì)胞凋亡清除受損傷的或衰老無用的細(xì)胞，保持細(xì)胞死亡和增殖的平衡。成骨細(xì)胞作為骨生長改建的效應(yīng)細(xì)胞，在骨改建的機制中處于“中心調(diào)控地位”。成骨細(xì)胞凋亡速度對保持骨重建的平衡有重要作用［1］，研究發(fā)現(xiàn)在顱骨快速生長期的骨縫邊緣、骨折愈合期和牽張成骨過程中均發(fā)現(xiàn)有成骨細(xì)胞凋亡的發(fā)生［1-3］，早期出現(xiàn)在骨改建區(qū)域的成骨細(xì)胞中50%-70%無法分化為成熟的骨細(xì)胞參與成骨［4］。體外研究發(fā)現(xiàn)，去血清培養(yǎng)可以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，在此基礎(chǔ)上施加周期性張應(yīng)變，不同大小和持續(xù)時間的周期性張應(yīng)變對成骨細(xì)胞凋亡有不同的影響［4-7］。然而目前血清對周期性張應(yīng)變作用下體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞凋亡的影響的研究結(jié)果尚不明了，也缺乏相應(yīng)調(diào)控機制的研究。

本研究通過不同血清培養(yǎng)狀態(tài)下使用Flexcell 4000TM細(xì)胞應(yīng)變加載系統(tǒng)對大鼠顱頂骨成骨細(xì)胞施加周期性張應(yīng)變，研究血清對周期性張應(yīng)變作用下體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞凋亡的影響，評價血清對成骨細(xì)胞凋亡的作用，并從其對細(xì)胞凋亡相關(guān)基因caspase的影響分析其中機制。

1 材料與方法

1.1 原代成骨細(xì)胞體外分離和檢測

取＜24 h新生SD大鼠，無菌條件下獲取顱頂骨，采用次序性酶消化法分離成骨細(xì)胞，加入含10%FBS(V/V)的MEM培養(yǎng)基，接種于75 cm2培養(yǎng)瓶，次日吸去殘留骨片后隔日換液，細(xì)胞90%匯合時傳為P1代。取P2代細(xì)胞，培養(yǎng)l周后多數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)為堿性磷酸酶染色陽性;經(jīng)含β-甘油磷酸鈉和抗壞血酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)，2周后可形成明顯的礦化結(jié)節(jié)，茜素紅染色為鮮紅色，證實所獲成骨細(xì)胞具有體外成骨功能。本實驗采用P2-P4代的成骨細(xì)胞作為研究對象。

1.2 成骨細(xì)胞培養(yǎng)和周期性張應(yīng)變加載

采用Flexcell 4000TM細(xì)胞應(yīng)變加載系統(tǒng)(Flexcell公司，美國)培養(yǎng)和加載成骨細(xì)胞。將同一代次的成骨細(xì)胞以1×105/孔接種于細(xì)胞加力板，培養(yǎng)4 d后，更換培養(yǎng)液，施加變形率為6%或12%的周期性張應(yīng)變，頻率為0.5 Hz，連續(xù)加載72 h。根據(jù)加力時使用培養(yǎng)液中血清含量分為血清組(+serum)和無血清組(-serum)。對照組采用相同培養(yǎng)方式，但不加力。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測成骨細(xì)胞凋亡

細(xì)胞加力后即刻收獲細(xì)胞，運用AnnexinⅤ-FITC/PI(BD Pharmingen，美國)雙染色法及流式細(xì)胞技術(shù)檢測成骨細(xì)胞早期凋亡。將無血清對照組的凋亡率作為1，分別計算其余各組的凋亡比率。

1.4 ELISA法檢測caspase-3表達(dá)

細(xì)胞加力后即刻收獲細(xì)胞，用1 ml RIPA(上海博彩生物科技有限公司，中國)與100μl苯甲基磺酰氟(PMSF，sigma，美國)混合液于冰上裂解細(xì)胞。裂解后細(xì)胞蛋白液運用大鼠caspase-3 ELISA試劑盒(R＆D Systems，美國)描繪標(biāo)準(zhǔn)曲線并檢測，使用酶標(biāo)儀(Safire2，瑞士)在450 nm處測吸光值。根據(jù)樣品OD值在已描繪的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖上查出相應(yīng)caspase-3含量。

1.5 real time PCR 法檢測 caspase-8，9表達(dá)

細(xì)胞加力后即刻收獲細(xì)胞，采用TRIZOL(Invitrogen，美國)法提取細(xì)胞總RNA，采用QuantiTect Rev.Transcription Kits試劑盒(Qiagen，德國)逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，采用 QuantiTect SYBR Green PCR Kits(Qiagen，德國)于 ABI PRISM 7900實時定量 PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，美國)進(jìn)行目的基因(caspase-8，9)real-time PCR定量分析。引物序列見表1，實驗操作按試劑盒說明進(jìn)行，計算各測試基因與內(nèi)參基因GAPDH比值，作相對量分析。

表1 real time RT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for RT-PCR

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

以上所有試驗均作3次重復(fù)，應(yīng)用SAS 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，進(jìn)行獨立樣本t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 成骨細(xì)胞受周期性張應(yīng)變作用后早期細(xì)胞凋亡分析

在含血清的培養(yǎng)液中，對照組成骨細(xì)胞與周期性張應(yīng)變作用的成骨細(xì)胞均呈現(xiàn)較低水平的細(xì)胞凋亡，并且周期性張應(yīng)變對成骨細(xì)胞凋亡的影響不顯著。在無血清的培養(yǎng)液中，對照組成骨細(xì)胞就呈現(xiàn)一定的凋亡比率，并與血清組成骨細(xì)胞凋亡比率有顯著差異(P＜0.01)，無血清組細(xì)胞在6%的周期性張應(yīng)變作用72 h后，成骨細(xì)胞凋亡率為對照組的49%，兩者有顯著差異(P＜0.05)。而在12%的周期性張應(yīng)變作用下，成骨細(xì)胞凋亡有顯著增加(P＜0.01)，為對照組的292%。在相同加力條件下，無血清組成骨細(xì)胞的凋亡比率較血清組有顯著增加，分別為 132%(6%周期性張應(yīng)變，P＜0.05)和912%(12%周期性張應(yīng)變，P ＜0.01，見圖1)。

圖1 周期性應(yīng)變力作用下大鼠成骨細(xì)胞凋亡的定量分析Figure 1 Apoptosis of rat osteoblast after 72 h stretch loading

2.2 成骨細(xì)胞受周期性張應(yīng)變作用后caspase-3的活性表達(dá)

在含血清的培養(yǎng)液中，對照組成骨細(xì)胞與周期性張應(yīng)變作用的成骨細(xì)胞均呈現(xiàn)較低水平的caspase-3活性表達(dá)，并且周期性張應(yīng)變對成骨細(xì)胞caspase-3表達(dá)的影響不顯著。在無血清的培養(yǎng)液中，對照組成骨細(xì)胞就呈現(xiàn)一定的caspase-3活性表達(dá)，并與血清組成骨細(xì)胞凋亡比率有顯著差異(P＜0.01)，無血清組細(xì)胞在6%的周期性張應(yīng)變作用72 h后，成骨細(xì)胞 caspase-3活性表達(dá)為對照組的66%，兩者有顯著差異(P＜0.05)。而在12%的周期性張應(yīng)變作用下，成骨細(xì)胞caspase-3活性有顯著增加(P＜0.01)，為對照組的156%。在相同加力條件下，無血清組成骨細(xì)胞較血清組的caspase-3活性有顯著增加(P＜0.01，見圖2)，分別為374%(6%周期性張應(yīng)變)和777%(12%周期性張應(yīng)變)。

圖2 周期性應(yīng)變力作用下大鼠成骨細(xì)胞caspase-3活性表達(dá)分析Figure 2 Caspase-3 activity of rat osteoblast after 72 h of stretch loading

2.3 成骨細(xì)胞受周期性張應(yīng)變作用后caspase-8，9的基因表達(dá)

成骨細(xì)胞在周期性張應(yīng)變作用下，血清組和無血清組細(xì)胞的caspase-8表達(dá)呈現(xiàn)相似趨勢，6%的周期性張應(yīng)變作用72 h后，成骨細(xì)胞caspase-8表達(dá)分別下調(diào)46%(血清組)和48%(無血清組)，與對照組差異顯著(P＜0.05)。在12%的周期性張應(yīng)變作用下，成骨細(xì)胞caspase-8表達(dá)顯著增加(P＜0.05)，分別為對照組的1 006%(血清組)和768%(無血清組)。而相同加力條件下，血清組和無血清組成骨細(xì)胞caspase-8表達(dá)無顯著差異(圖3 A)。

血清組和無血清組成骨細(xì)胞在周期性張應(yīng)變作用下，caspase-9組內(nèi)表達(dá)無明顯差異。而在相同加力條件下，血清組成骨細(xì)胞較無血清組的caspase-9活性有顯著降低(P＜0.05，圖3B)，分別為51%(6%應(yīng)變力)和43%(12%應(yīng)變力)。

3 討論

在外界機械力刺激下，成骨細(xì)胞的反應(yīng)是骨組織發(fā)生適應(yīng)性改建的基礎(chǔ)［8］。成骨細(xì)胞體外應(yīng)力加載為研究成骨細(xì)胞對機械力的生物學(xué)反應(yīng)提供了可能。目前發(fā)現(xiàn)，不同的加力方式(如加載裝置，力值大小、加力時間、加力頻率等)會導(dǎo)致研究結(jié)果大相徑庭［9-12］。在相同的力學(xué)加載條件下，不同級別的機械牽張刺激—高(21%)、中(14%)和低(7%)—對成骨細(xì)胞分化水平影響有所不同［13］，且無血清培養(yǎng)條件中成骨細(xì)胞無法承受超過15%的周期性張應(yīng)變作用，而不足24 h的力學(xué)刺激對成骨細(xì)胞凋亡作用不明確，另外1 Hz以上的作用頻率會增加張應(yīng)變作用過程中的流體剪切效應(yīng)［14］。綜合以上前人研究結(jié)果并根據(jù)原代成骨細(xì)胞的生長曲線，本研究選用對數(shù)生長期的結(jié)束時間點(4 d)的細(xì)胞進(jìn)行力學(xué)加載分析。使用Flexcell 4000TM細(xì)胞應(yīng)變加載系統(tǒng)，對成骨細(xì)胞施加均勻的等軸牽張力。采用了6%和12%兩個張應(yīng)變參數(shù)，以0.5 Hz的頻率對細(xì)胞加載72 h的周期性張應(yīng)變。根據(jù)加力時細(xì)胞培養(yǎng)液中是否含有血清分為血清組和無血清組。

圖3 周期性應(yīng)變力作用下大鼠成骨細(xì)胞caspase-8(A)和caspase-9(B)的基因表達(dá)分析Figure 3 Gene expression of caspase-8(A)and 9(B)in rat osteoblasts after 72 h stretch loading

本研究結(jié)果顯示，在含血清的培養(yǎng)液中，成骨細(xì)胞均呈現(xiàn)較低水平的細(xì)胞凋亡，且周期性張應(yīng)變對細(xì)胞凋亡的影響不顯著。在無血清的培養(yǎng)液中，對照組成骨細(xì)胞已呈現(xiàn)一定的凋亡比率，且明顯高于血清組(P＜0.01)，應(yīng)力條件下，6%的周期性張應(yīng)變抑制成骨細(xì)胞的凋亡，而12%的周期性張應(yīng)變則促進(jìn)成骨細(xì)胞的凋亡(圖1)。提示無血清狀態(tài)下，周期性張應(yīng)變可以調(diào)控成骨細(xì)胞凋亡的發(fā)生，其中力值大小起重要作用，這與以往研究結(jié)果一致［7，12］。而血清的存在使得周期性張應(yīng)變對成骨細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用明顯減弱。而這一趨勢在caspase-3的活性檢測中也得到相似結(jié)果(見圖2)。目前在動物細(xì)胞培養(yǎng)中，血清起到很重要的作用，它能夠提供細(xì)胞生長必需的基本營養(yǎng)物質(zhì);提供激素和各種生長因子;提供結(jié)合蛋白攜帶重要的低分子量物質(zhì)，在細(xì)胞代謝過程中起重要作用;提供促接觸和伸展因子使細(xì)胞貼壁免受機械損傷;對培養(yǎng)中的細(xì)胞起到某些保護(hù)作用;提供酸堿緩沖物質(zhì)，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值;影響培養(yǎng)系統(tǒng)中的某些物理特性如:剪切力、黏度、滲透壓和氣體傳遞速度等［15］。研究證實，血清的存在與否對細(xì)胞凋亡表達(dá)水平有顯著影響，并且這種影響在不同種類細(xì)胞中呈現(xiàn)相似性［16-18］。

我們的研究結(jié)果還顯示，成骨細(xì)胞在周期性張應(yīng)變作用下，血清組和無血清組細(xì)胞的caspase-8表達(dá)呈現(xiàn)相似趨勢，即6%的周期性張應(yīng)變下調(diào)其表達(dá)而12%的周期性張應(yīng)變促進(jìn)其表達(dá)。而血清組和無血清組成骨細(xì)胞在周期性張應(yīng)變作用下，caspase-9組內(nèi)表達(dá)無明顯差異，但是在相同加力條件下，血清組成骨細(xì)胞較無血清組的caspase-9活性顯著降低(見圖3)，提示caspase-8表達(dá)與應(yīng)力相關(guān)而Caspase9表達(dá)主要受血清影響。在caspase-家族中，與細(xì)胞凋亡相關(guān)的caspase-主要分為起始和執(zhí)行 caspase-兩大類［18，19］，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時，起始caspase-在外來蛋白信號的作用下被切割激活后，它對執(zhí)行caspase進(jìn)行切割并使之激活，被激活的執(zhí)行者caspase通過對 caspase-靶蛋白的水解，形成caspase 級聯(lián)反應(yīng)，促發(fā)細(xì)胞凋亡［20，21］。caspase 級聯(lián)反應(yīng)主要涉及死亡受體途徑和線粒體途徑兩條途徑。死亡受體途徑主要由腫瘤壞死因子受體超家族激活caspase-8從而激活caspase級聯(lián)反應(yīng)。而線粒體途徑則是細(xì)胞內(nèi)部線粒體內(nèi)分泌的細(xì)胞色素C誘發(fā)刺激激活caspase-9從而激活caspase級聯(lián)反應(yīng)。而我們的研究結(jié)果提示，血清對成骨細(xì)胞凋亡比率的下調(diào)作用與caspase-級聯(lián)反應(yīng)有關(guān)。根據(jù)結(jié)果，caspase-8的表達(dá)與血清的存在無相關(guān)性，而caspase-9和caspase-3的表達(dá)都因血清的存在而下調(diào)，說明血清主要是通過caspase-9/3的途徑對成骨細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響。而caspase-9/caspase-3的途徑則主要涉及細(xì)胞內(nèi)部線粒體內(nèi)分泌的細(xì)胞色素C，由此可推得血清對成骨細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用主要是通過抑制細(xì)胞內(nèi)線粒體分泌細(xì)胞色素C從而下調(diào)caspase-9的表達(dá)。

綜上所述，無血清狀態(tài)下周期性張應(yīng)變對成骨細(xì)胞的凋亡有影響，血清對周期性應(yīng)變力影響的成骨細(xì)胞的凋亡有減弱作用。由此提示，成骨細(xì)胞的凋亡在應(yīng)力介導(dǎo)的骨改建中發(fā)揮著重要作用。闡明成骨細(xì)胞凋亡的生物學(xué)機制，將有助于充分認(rèn)識臨床上骨重建的過程和指導(dǎo)骨質(zhì)疏松、骨折愈合的綜合治療。通過細(xì)胞因子、基因誘導(dǎo)等方法調(diào)控成骨細(xì)胞的凋亡，可能成為將來治療骨骼疾病和促進(jìn)骨重建修復(fù)的一條有效途徑。

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