孫 彥，孟永亮(山東萬杰醫(yī)學院醫(yī)學系內(nèi)科學教研室，淄博 255213)

端粒是真核生物細胞染色體末端的一個特殊結(jié)構(gòu)，與細胞生長、增殖、衰老，腫瘤發(fā)生等密切相關(guān)。端粒組分包括長5-20 kb的雙鏈重復序列(TTAGGG)n，一條3’富含G的單鏈懸突(G尾)和端粒結(jié)合蛋白［1］。端粒3’末端單鏈懸突可形成四鏈狀DNA結(jié)構(gòu)，即鳥嘌呤-四鏈體(guanine-quadruplex，G4)。G4在端粒酶催化的端粒延伸反應(yīng)過程中的重要調(diào)節(jié)作用已受到人們的重視，能夠特異作用于G4的小分子化合物對靶向端粒的腫瘤治療有重要意義［2-4］。研究［5］發(fā)現(xiàn)，某些蒽醌類化合物具有誘導G4形成和穩(wěn)定G4結(jié)構(gòu)的作用，而且在一些腫瘤細胞株內(nèi)顯示出抑制端粒酶活性及對腫瘤細胞生物學性狀產(chǎn)生影響的特性?；诖?，本研究選用蒽醌類代表性藥物(阿霉素)，觀察阿霉素誘導鳥嘌呤四聯(lián)體形成，并研究其對SW480細胞端粒酶活性的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

阿霉素(大連美侖生物技術(shù)有限公司);線性寡核苷 酸 序 列 d(TTAGGG)、d(TTAGGG)2、d(TTAGGG)3、d(TTAGGG)4、d(TTAGGG)5、d(TTGGAG)4、d(TGTAGG)4、d(TAGGTG)4、d(TTGAGG)4(上海生物工程公司合成，廣西醫(yī)科大學腫瘤學實驗室保存);端粒酶檢測試劑盒(美國羅氏生物公司);MTT(AMRESCO)。

1.2 阿霉素對SW480細胞增殖抑制的影響(MTT法)

取對數(shù)生長期的SW480細胞制成5×104細胞懸液，取100 μl接種于96孔培養(yǎng)皿內(nèi)，向培養(yǎng)孔內(nèi)加入不同濃度的阿霉素溶液，共分為5組:空白對照組，阿霉素2.5 μg/ml組，阿霉素 5 μg/ml組，阿霉素10 μg/ml組，阿霉素 20 μg/ml組。分別培養(yǎng)24，48，72，96 h 后，每孔加入 MTT 液20 μl，再培養(yǎng)4 h，去上清，每孔加入150 μl DMSO，空白孔用二甲基亞砜調(diào)零，酶標儀檢測波長490 nm處吸光度OD值。實驗重復三次，計算平均值。抑制率=［(對照-空白)-(實驗-空白)］/(對照 -空白)×100%，以時間(h)為橫坐標，細胞生長抑制率為縱坐標，繪制細胞生長抑制曲線圖。

1.3 阿霉素對 SW480細胞端粒酶活性的影響(TRAP法)

常規(guī)提取端粒酶，-70℃保存待用，取待測樣品 50 μg(總蛋白)，反應(yīng)體積為 20 μl，其中含引物TS(5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’)及 CX(5’-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3’)，25℃，30 min，PCR 擴增儀。取5 μl擴增產(chǎn)物，加入20 μl變性試劑，25 ℃孵育10 min，再加入225 μl雜交緩沖液，振蕩混勻后取100 μl混合物加入已包被微孔板的孔中，37℃，300 r/min振蕩2 h，棄去雜交液，緩慢用清洗液沖洗三次，加入抗地高辛復合物工作液100 μl，25 ℃，30 min，再用清洗緩沖液洗5 次，加入 TMB 底物溶液 100 μl，20 min 后再加入 100 μl終止液終止反應(yīng)。用酶標儀測定A450nm和A630nm的吸光度值(A值)。

陽性結(jié)果判斷:陽性對照為SW480細胞，陰性標本經(jīng)65℃，加熱30 min滅活端粒酶后作為陰性對照。陽性對照吸光度應(yīng)大于1.5，陰性對照吸光度應(yīng)小于0.25，待測標本ΔA=標本吸光度A值-陰性對照吸光度A值，若標本ΔA＞0.2，即為端粒酶陽性。

1.4 阿霉素對鳥嘌呤四聯(lián)體結(jié)構(gòu)及其相似物的影響

通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測不同濃度阿霉素對端粒重復序列d(TTAGGG)4電泳遷移速度的影響。在24℃條件下，將5 nmol d(TTAGGG)4與10 μl反應(yīng)緩沖液充分混合，孵育13 min，加入不同濃度阿霉素，共分為四組(0，1.25，2.5，5 μg/ml)，孵育3 h，加入4 μl反應(yīng)緩沖液，在4 ℃條件下行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠濃度12%，電泳時間30 min。檢測5 μg/ml阿霉素對不同端粒重復序列 d(TTAGGG)、d(TTAGGG)2、d(TTAGGG)3、d(TTAGGG)4、d(TTAGGG)5電泳遷移速度的影響。檢測 5 μg/ml阿霉素對端粒重復序列d(TTAGGG)4及其類似物 d(TTGGAG)4、d(TGTAGG)4、d(TAGGTG)4、d(TTGAGG)4 電泳遷移速度的影響。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，方差齊采用LSD法檢驗并進行兩兩組間比較，方差不齊采用Dunnett’s法檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 阿霉素對SW480細胞增殖抑制的影響

MTT結(jié)果顯示，阿霉素對SW480細胞增殖有抑制作用，與藥物濃度和培養(yǎng)時間有關(guān)，藥物濃度越大，培養(yǎng)時間越長，抑制細胞增殖越明顯(見圖1)，2.5 μg/ml和 5 μg/ml的阿霉素培養(yǎng) 48 h 時，細胞的增殖抑制率 ＜ 50%，10 μmol/L、20 μmol/L 的阿霉素，細胞增殖抑制率＞50%;而5 μg/ml阿霉素培養(yǎng)72 h時，細胞增殖抑制率＞50%。跟據(jù)亞細胞毒理論，選擇抑制率在50%以下的最小濃度作為后續(xù)實驗的阿霉素濃度。據(jù)此，選用2.5 μmol/L的阿霉素作為后續(xù)研究濃度，培養(yǎng)48 h。

圖1 不同濃度阿霉素不同時間對SW480細胞生長抑制的影響Figure 1 Effect of adriamycin on SW480 cell growth

2.2 阿霉素對SW480細胞端粒酶活性的影響

不同濃度阿霉素作用于SW480細胞48 h后，隨著濃度的增加，端粒酶活性逐步減弱，與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，見圖2)。

2.3 阿霉素對鳥嘌呤四聯(lián)體結(jié)構(gòu)及其相似物的影響

在不同阿霉素濃度下，端粒重復序列d(TTAGGG)4遷移速度不同，隨著阿霉素濃度的增加，電泳遷移速度逐漸加快;無阿霉素作用時，電泳遷移較慢;1.25，2.5 μg/ml阿霉素作用時，電泳遷移速度加快，但存在部分拖尾現(xiàn)象，表明低濃度阿霉素作用時，四聯(lián)體結(jié)構(gòu)形成較慢;當5μg/ml阿霉素作用時，電泳遷移速度增快，條帶變得清晰、完整，無拖尾現(xiàn)象(見圖3)。

圖2 不同濃度阿霉素作用48 h后SW480細胞端粒酶活性比較Figure 2 Comparison of telomerase activity of SW480 cells after treated with different concentrations of adriamycin for 48 h

圖3 不同濃度阿霉素對d(TTAGGG)4電泳遷移速度的影響Figure 3 Effect of different concentrations of adriamycin on electrophoretic migration speed of d(TTAGGG)4

5 μg/ml阿霉素可使端粒序列重復4次以上的遷移速度加快，對端粒序列重復4次以下的遷移速度無影響(見圖4)。

5 μg/ml阿霉素對端粒重復序列d(TTAGGG)4及其類似物電泳遷移速度的影響:d(TTAGGG)4的電泳遷移速度顯著快于核苷酸序列分子量和所帶電荷相同的類似物 d(TTGGAG)4、d(TGTAGG)4、d(TAGGTG)4、d(TTGAGG)4、d(TTAGGG)4，表明GGG串聯(lián)區(qū)是阿霉素誘導形成緊湊二級結(jié)構(gòu)的重要前提條件，導致遷移速度加快(見圖5)。

3 討論

圖4 5 μg/ml阿霉素對端粒序列不同重復次數(shù)電泳遷移速度的影響Figure 4 Effect of 5 μg/ml adriamycin on electrophoretic migration speed of different telomere repeat sequences

圖5 5 μg/ml阿霉素對端粒重復序列d(TTAGGG)4及其相似物電泳遷移速度的影響Figure 5 Effect of 5 μg/ml adriamycin on electrophoretic migration speed of telomere repeat sequence d(TTAGGG)4 and its analogues

腫瘤細胞是在端粒酶受到因子激活的狀態(tài)下，繼續(xù)延伸端粒，無限制地進行細胞分裂轉(zhuǎn)化而成的［4］。因此，只要抑制腫瘤細胞中的端粒酶活性，便可以達到抗腫瘤的目的。G4是在DNA處于開鏈狀態(tài)下，富含G序列的核苷酸以氫鍵進行堿基配對形成的端粒的特殊二級結(jié)構(gòu)［7］，G4形成可影響端粒酶引起的端粒延長［8］，阻止端粒酶與端粒結(jié)合，干擾端粒復制。因此，穩(wěn)定G4結(jié)構(gòu)可以抑制端粒酶活性。大量的相關(guān)研究表明，通過G-四聯(lián)體特異性配體的穩(wěn)定作用，導致了端粒酶活性的降低，因而阻止了端粒的延長［9］。研究［10］發(fā)現(xiàn)，有多種蒽醌類衍生物可通過插入到含端粒重復序列的寡核苷酸分子中，誘導G4形成并使之穩(wěn)定;而這些衍生物在充當G4配體時，在某些腫瘤細胞系內(nèi)會對其端粒酶活性及腫瘤細胞生物學行為產(chǎn)生影響。本研究選用阿霉素作為G4配體，細胞外觀察阿霉素誘導鳥嘌呤四聯(lián)體形成，細胞內(nèi)研究其對SW480細胞端粒酶活性的影響，初步探討G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)的生物學功能和對SW480細胞端粒酶介導端粒延伸反應(yīng)的影響。

本研究中為避免嚴重細胞毒作用對SW480細胞端粒酶活性檢測的干擾，避免短期凋亡和其他非特異情況發(fā)生。首先進行了阿霉素細胞毒性實驗，根據(jù)MTT結(jié)果，確定了作用時間48 h，作用濃度2.5 μmol/L阿霉素作為本研究的細胞內(nèi)濃度。在TRAP檢測中，不同作用濃度的阿霉素對SW480細胞端粒酶活性有明顯抑制作用。結(jié)合細胞毒性試驗，說明2.5 μmol/L阿霉素是較合適的細胞內(nèi)作用濃度，不會產(chǎn)生過大的細胞毒作用，在抑制SW480細胞增殖的同時，可以對其端粒酶活性產(chǎn)生抑制作用。

本研究發(fā)現(xiàn)阿霉素可促使含端粒重復序列的核苷酸形成高度有序的緊湊二級結(jié)構(gòu)，GGG串聯(lián)是阿霉素誘導緊湊二級結(jié)構(gòu)形成的重要前提條件。端粒序列重復的次數(shù)是形成端粒四聯(lián)體結(jié)構(gòu)的重要因素［11］，4個鳥嘌呤堿基通過Hoogsteen氫鍵的配對方式循環(huán)排列連接而形成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，再通過適當體積的陽離子與鳥嘌呤堿基的負電羰基集團結(jié)合，由此形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)。本研究發(fā)現(xiàn)阿霉素可使端粒序列重復4次及以上的含GGG串聯(lián)區(qū)的線性核苷酸結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，形成緊湊的二級結(jié)構(gòu)，導致遷移速度加快。端粒重復序列小于3次者，無法形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，因而電泳遷移條帶沒有改變。這與胡曉文等［10］采用改良TRAP-G4法檢測阿霉素誘導G4形成及其對Tca8113細胞端粒酶介導端粒延伸反應(yīng)的影響結(jié)果一致。本研究結(jié)果提示在細胞外，阿霉素可能誘導含端粒重復序列的核苷酸形成G4結(jié)構(gòu)。

本實驗結(jié)果表明:在細胞內(nèi)，阿霉素可抑制SW480增殖，抑制端粒酶活性;在細胞外，阿霉素可誘導含端粒重復序列的核苷酸形成G4結(jié)構(gòu)。提示阿霉素在細胞內(nèi)抑制SW480細胞端粒酶活性與其誘導G4形成有關(guān)。本研究設(shè)計的端粒序列及其類似物主要是通過化學法合成，與人體內(nèi)生物條件下存在的端粒序列尚存在許多差異，如何尋找一種較好的能夠從SW480細胞中提取端粒結(jié)構(gòu)的方法將是我們進一步研究的內(nèi)容。

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