周元元，楊嘉，盧偉，張鵬，朱姜，王帥

（揚州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，江蘇 揚州 225000）

0 引 言

雙氰胺，又名二聚氰胺，二氰二胺。新西蘭的部分農(nóng)場將其用作硝化抑制劑，其目的是為了降低水中硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)和減少溫室氣體排放，但是通過食物鏈的傳遞，雙氰胺會到達(dá)奶粉中，最終進入人體中。新西蘭檢測了近2000個奶粉樣品，有371個樣品中檢出雙氰胺。在我國消費者對乳制品的安全特別重視和關(guān)注，因此有必要對奶粉中的雙氰胺進行監(jiān)測。

目前奶粉中雙氰胺的檢測方法主要是液相色譜-質(zhì)譜法[1-2]，同時還有其他食品、藥品、空氣中雙氰胺的檢測報道，主要是液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜法[3-6]。液質(zhì)儀器價格昂貴，操作專業(yè)要求高，因此普及率不高。樣品基質(zhì)的差異使上述文獻中的前處理方法無法滿足奶粉樣品的檢測。本文通過對提取溶劑和色譜分離條件的優(yōu)化，建立了高效液相色譜測定奶粉中雙氰胺質(zhì)量濃度的方法。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

雙氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%），0.22 μm針式微孔濾膜過濾器，甲醇、乙醇、乙腈為色譜純，乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、三氯乙酸、氨水均為國產(chǎn)分析純，實驗用水符合GB/T 6682一級水要求。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1200高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測器），渦旋混合器，Milli-Q Academic超純水機，Sartorius CP225D型電子天平，SIGMA 3K15高速離心機，KQ-250E型超聲波清洗器。

1.3 色譜條件

色譜柱：Shodex Asahipak NH2P-50 4E氨基柱（4.6mm×250mm，5 μm）；柱溫為40 ℃；進樣量為10 μL；流動相：乙腈-水 (70∶30，體積比)，其中每100 mL水中添加25%氨水0.2 mL；流速為1.0 mL/min；檢測波長為218 nm。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取適量雙氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解得到質(zhì)量濃度為500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備液， 配制成質(zhì)量濃度為0.008，0.02，0.08，0.4，2.0，4.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)使用液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定線性范圍。

1.5 樣品處理

稱取2 g均勻樣品(準(zhǔn)確至0.001 g)，置于50 mL具塞刻度試管中，加水10 mL，充分溶解后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%三氯乙酸水溶液定容至滿刻度，超聲5 min后靜置20 min,上清液經(jīng)0.22 μm 水系濾膜過濾，供HPLC分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 色譜柱的選擇

雙氰胺的極性較強，C18柱對其沒有保留，需要使用離子對試劑，而后者對色譜柱有一定的傷害，并且檢測重復(fù)性和重現(xiàn)性較差。氨基柱能用于分離極性較大的物質(zhì)，根據(jù)雙氰胺的性質(zhì)，本實驗選擇了氨基柱作為分析色譜柱。

2.1.2 檢測波長的選擇

取質(zhì)量濃度為2 mg/L的雙氰胺標(biāo)準(zhǔn)使用液及待檢樣品處理液，在190～400 nm波長處進行掃描，發(fā)現(xiàn)雙氰胺在218 nm處有較大吸收峰(圖1)，且樣品處理液雜峰少，因此選擇218 nm作為檢測波長。測定中采用了二極管陣列檢測器對其進行光譜掃描，結(jié)合保留時間和掃描光譜圖相似性進行定性。

圖1 雙氰胺光譜

2.1.3 流動相的選擇

嘗試了反相色譜分析中氨基色譜柱常用流動相乙腈和水的不同配比，結(jié)合標(biāo)樣色譜圖峰型和樣品處理液的分離效果 （圖2和圖3），確定了最佳的流動相條件。

2.2 提取方法的優(yōu)化

圖2 雙氰胺標(biāo)樣色譜

圖3 雙氰胺奶粉樣品色譜

參照雙氰胺的溶解性，選擇了甲醇、乙醇、乙腈、1%三氯乙酸作為提取試劑定容，并配合兩種沉淀方法：（1）加水溶解樣品后加入1.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%亞鐵氰化鉀和1.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%乙酸鋅；（2）加水溶解樣品后加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%乙酸鉛，進行提取條件的優(yōu)化。經(jīng)過反復(fù)試驗和加標(biāo)回收試驗發(fā)現(xiàn)不使用沉淀劑，直接用甲醇或質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%三氯乙酸定容、振蕩提取效果較好，且兩種方法加標(biāo)回收率差異不顯著。考慮到質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%三氯乙酸水溶液減少了有機試劑的使用，降低了實驗人員與有機試劑的接觸機會，對環(huán)境更加友好，因此選擇1%三氯乙酸水溶液作為提取溶劑。

2.3 線性范圍和檢出限

參照“1.4”配制雙氰胺標(biāo)準(zhǔn)使用液，按“2.1”色譜條件進行測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制曲線，在質(zhì)量濃度為0.008～4.0 mg/L范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度與峰面積值具有良好的線性關(guān)系（圖4），回歸方程y=90.59x+2.7451，r=0.9998。將已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液不斷稀釋，當(dāng)S/N為3時，最低儀器檢出限為1 μg/L，方法的定量下限為0.08 mg/kg。

圖4 雙氰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 回收率和精密度

準(zhǔn)確稱取陰性對照奶粉進行加標(biāo)實驗，計算回收率和精密度。分別進行三水平加標(biāo)測試，每個水平測定6次，計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如表1所示。由表1可以看出，不同添加水平下，回收率范圍為84.7%～103.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.29%～3.48%之間，完全可以滿足日常分析的要求。

表1 加標(biāo)回收率及精密度實驗結(jié)果

3 結(jié) 論

本文建立了高效液相色譜法測定奶粉中雙氰胺質(zhì)量濃度的檢測方法，方法精密度、回收率和檢出限能滿足實際樣品檢測的需要。樣品前處理過程簡單，不使用有機溶劑，無復(fù)雜的凈化步驟，降低檢測成本的同時也降低了檢驗人員的健康風(fēng)險，對環(huán)境更加友好。二極管陣列檢測器的使用降低了實驗室檢測的門檻，易于推廣和應(yīng)用，便于基層食品監(jiān)管機構(gòu)及時有效地對奶粉安全進行監(jiān)控。

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[3]王祖翔，蔣俊，孫莉，等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定食品中的尿素_縮二脲與雙氰胺[J].分析測試學(xué)報，2012,31(5):593-599.

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