張宇坤,王淑瑩,董怡君,彭永臻 (北京工業(yè)大學北京市水質科學與水環(huán)境恢復工程重點實驗室,北京 100124)

游離氨和游離亞硝酸對亞硝態(tài)氮氧化菌活性的影響

張宇坤,王淑瑩*,董怡君,彭永臻 (北京工業(yè)大學北京市水質科學與水環(huán)境恢復工程重點實驗室,北京 100124)

高濃度游離氨(FA)或游離亞硝酸(FNA)條件下硝化過程常出現(xiàn)亞硝態(tài)氮積累,FA、FNA對亞硝態(tài)氮氧化菌(NOB)的影響并不清楚.首先用高濃度亞硝態(tài)氮污水富集培養(yǎng) NOB,對富含 NOB的污泥進行熒光原位雜交技術(FISH)分析表明,Nitrobacter占細菌總數(shù)比例為(71±5)%.用此污泥考察不同 FA、FNA 濃度對 NOB活性的影響.結果表明,NOB的活性隨著 FA 濃度的增大逐漸減小,當 FA 濃度在10mgNH3-N/L左右時,NOB的活性僅為FA為0時的50%.低濃度的FNA(FNA < 0.03mg HNO2-N/L)對NOB活性具有促進作用;當FNA≥0.2mg/L時,NOB的活性被完全抑制.采用Aiba模型計算得到FNA對NOB的抑制常數(shù)KI,FNA,NOB為0.0968mg/L. FNA在0.0968mg/L左右時NOB活性僅為FNA為0.003mg/L時的50%.

活性；游離氨；游離亞硝酸；亞硝態(tài)氮氧化菌；抑制

生物脫氮技術是城市污水處理的常用技術,硝化過程是生物脫氮過程的限速步驟[1].先由氨氧化菌(AOB)將氨氮氧化為亞硝態(tài)氮,再由亞硝態(tài)氮氧化菌(NOB)將亞硝態(tài)氮氧化為硝態(tài)氮.短程硝化反硝化工藝(PND)就是將硝化過程控制在氨氧化階段,防止亞硝態(tài)氮氧化菌將亞硝態(tài)氮氧化為硝態(tài)氮.由于其具有節(jié)省 25%的曝氣能耗、減少 40%的碳源投量等優(yōu)點,成為污水處理領域的研究熱點[2-4].

實現(xiàn)短程硝化反硝化工藝需要抑制NOB,使得AOB成為硝化菌群的優(yōu)勢菌種.AOB和NOB競爭的影響因素有:pH值[5]、溫度[3]、溶解氧(DO)濃度[6]、游離氨(FA)[7-9]、游離亞硝酸(FNA)[10-12]等.其中,FA、FNA是影響AOB、NOB競爭的重要因素, Anthonisen[13]發(fā)現(xiàn)高濃度氨氮和亞硝態(tài)氮對硝化菌群存在抑制,但Van等[14-15]認為FA、FNA才是抑制硝化菌群活性的真正抑制劑.FNA對微生物活性和生長速率存在強烈的抑制作用,對污水處理廠微生物種群結構也存在影響[16].目前,現(xiàn)有的研究多集中于FA或FNA對AOB和短程硝化效果的影響[5,7-12],但對 NOB的影響還研究較少[17-18].污水處理廠污泥中 NOB占細菌總數(shù)比例一般低于 5%,采用此類污泥研究 NOB的性質容易影響試驗結果的可靠性和穩(wěn)定性.對NOB進行富集培養(yǎng)有利于提高 NOB占細菌總數(shù)比例,從而獲得更加準確的實驗結論.Vadivelu等[17-18]嘗試富集培養(yǎng)NOB,所得到的系統(tǒng)污泥濃度較低(可揮發(fā)性固體濃度約為 650mg/L),與實際污水處理設施污泥濃度差別較大.關于采用富集程度高的富含NOB污泥研究FA、FNA對NOB的活性影響還未見報道.本試驗擬采用序批式反應器(SBR)裝置富集培養(yǎng)NOB,以富含NOB的活性污泥為研究對象,采用批次試驗研究FA、FNA濃度對 NOB活性的影響,并對 FA、FNA影響NOB活性的原因進行分析,旨在為短程硝化反硝化技術的應用提供理論支持.

1 材料與方法

1.1 亞硝態(tài)氮氧化菌富集裝置及運行方式

采用SBR裝置富集亞硝態(tài)氮氧化菌,SBR有效容積為 8L,排水比為 25%;通過溫控裝置控制溫度為(24±1)℃;曝氣量恒定為 0.2m3/h;通過 pH探頭的反饋信息控制蠕動泵,調節(jié)SBR裝置內混合溶液的pH值在7～7.5之間.每周期運行6h:進水(3h 20min),曝氣(5h,進水開始時即開始曝氣),沉淀0.5h,排水0.3h,閑置0.2h;其中進水方式為連續(xù)進水,每周期進水總量為2L.經(jīng)過420d富集培養(yǎng),NOB富集裝置每周期可處理進水-N濃度為1000mg/L的人工配水.

1.2 試驗用水水質及污泥來源

采用人工配水富集 NOB, 試驗用水均為滅菌后的去離子水.以 NaNO2作為唯一的能源, 其進水濃度范圍為100～1000mg-N/L每升配水中, 其他成分如下[17]:0.4g NaHCO3, 1g KH2PO4, 1.31g K2HPO4,以及2mL的微量元素溶液. 每升微量元素溶液中成分為[11]:1.25g EDTA,0.55g ZnSO4·7H2O, 0.4g CoCl2·6H2O, 1.275g MnCl2·4H2O, 0.4g CuSO4·4H2O, 0.05g Na2MoO4·2H2O, 1.375g CaCl2·2H2O, 1.25g FeCl3·6H2O, 44.4g MgSO4·7H2O. 接種污泥取自處理某大學居民區(qū)生活污水的中試 SBR,其污泥具有正常的硝化功能.

1.3 FA和FNA對NOB活性影響的批次試驗

游離氨(FA)一般采用下式計算[13]:

由公式(1)可知,FA是與氨氮濃度、溫度、pH值三者成正相關的函數(shù).本試驗擬采用恒定溫度(19℃)、恒定 pH(7.7),改變氨氮濃度來獲得不同F(xiàn)A濃度.

游離亞硝酸(FNA)一般采用下式計算[13]:

FNA是與亞硝態(tài)氮濃度、溫度、pH值三者相關的函數(shù),且與亞硝態(tài)氮濃度正相關,與pH值、溫度呈負相關.本試驗擬采用恒定溫度(19℃)、恒定pH(7.0),改變亞硝態(tài)氮濃度獲得不同F(xiàn)NA濃度.

采用批次試驗考察 FA、FNA濃度對 NOB活性的影響,批次試驗采用體積為500mL錐形瓶,每個批次反應時間為30min,每5min取樣過濾并測定氨氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮.反應過程中控制DO大于5mg/L.FA抑制試驗開始前根據(jù)試驗需要投加一定量的亞硝酸鈉、碳酸氫銨,使得混合液中亞硝態(tài)氮濃度 20mgNO2--N/L,氨氮濃度見表1; FNA抑制試驗采取的亞硝態(tài)氮濃度見表2.批次試驗結束時測定污泥濃度(MLSS)、可揮發(fā)性固體濃度(MLVSS).

1.4 Aiba動力學模型

Aiba動力學模型[19]為底物抑制動力學模型,本試驗中FNA既是NOB基質底物,同時也是抑制劑,通過指數(shù)相來模擬FNA對NOB活性的影響,動力學模型如公式(3)所示:

其中:r為NOB的比亞硝態(tài)氮氧化速率, rMAX為最大比亞硝態(tài)氮氧化速率,為FNA濃度(mgHNO2-N/L),KS為 NOB的底物半飽和常數(shù),KI,FNA,NOB為FNA對NOB的抑制常數(shù).本試驗中Ks值取1.5mg/L[17],在pH為7、溫度為19度時FNA值為0.000406mgHNO2-N/L,遠小于本試驗所取最小FNA濃度(0.003mgHNO2-N/L),因此方程(3)可以簡化為:

1.5 檢測指標及分析方法

氨氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮、MLSS、MLVSS均采用標準方法測定[20].熒光原位雜交技術(FISH)采用 Amann[21]的操作方法進行,采用 4%PFA, 4℃條件下對污泥樣品固定 2～3h.對固定后的污泥樣品超聲分散 1min,將樣品滴加在明膠包被過的載玻片上,干燥后先后浸泡于50%、80%和 98%的乙醇溶液中脫水 3min.雜交緩沖液組成包括0.9mol/L NaCl、20mmol/L Tris/HCl,0.01% SDS和甲酰胺(甲酰胺FA濃度見表2,pH為7.2).將熒光標記的寡核苷酸探針溶解于雜交緩沖液中,在46℃下與污泥樣品雜交2h.采用的寡核苷酸探針列于表3.雜交結束后,采用洗脫緩沖液在48℃下洗脫20min.在干燥后的樣品上滴加抗熒光衰減液,對每個污泥樣品隨機拍攝20～25張照片(OLYMPUS BX61 熒光顯微鏡)用于定量分析.

表1 游離氨批次試驗條件Table 1 Experimental conditions applied in FA batch tests

表2 游離亞硝酸批次試驗條件Table 2 Experimental conditions applied in FNA batchtests

表3 所用寡核苷酸探針堿基序列Table 3 Oligonucleotide probes used in this study

2 結果與討論

2.1 NOB富集裝置典型周期污染物變化情況及FISH分析

分析 FISH 結果,將圖 2(A)和(B)進行對比,可以發(fā)現(xiàn)硝化桿菌 Nitrobacter是污泥中優(yōu)勢菌屬,經(jīng) Image-pro-plus 6.0計數(shù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),Nitrobacter數(shù)量占細菌總數(shù)比例約為(71±5)%;將圖 2(C)和(D)進行對比發(fā)現(xiàn),NOB的另一種重要的硝化螺旋菌屬 Nitrospira含量很少,Nitrospira數(shù)量占細菌總數(shù)比例約為(2 ± 1)%.這說明在本試驗采用的培養(yǎng)方法更適合Nitrobacter的生長.

圖1 典型周期中-N,-N及參數(shù)變化規(guī)律(第435d)Fig.1 Variations of nitrite, nitrate and parameters with time in some typical cycle (435d)

圖2 第422d的NOB的FISH圖Fig.2 FISH images for NOB on day 422

2.2 游離氨(FA)對NOB活性影響

圖3顯示了NOB活性隨FA濃度的變化.將批次試驗的比亞硝態(tài)氮氧化速率與對照實驗(FA=0)的比亞硝態(tài)氮氧化速率相除,采用百分數(shù)比值來表征NOB的活性.可以看出,當FA濃度小于0.2mgNH3-N/L時,FA對NOB的活性影響不大(NOB活性大于 90%);當 0.2

式中:Y為NOB活性(%),X為FA濃度(mgNH3-N/L),相關性R2= 0.96.FA對NOB的抑制效果明顯,當FA濃度為10mgNH3-N/L時,NOB的活性僅為FA為0時的50%.與NOB相比,FA對AOB的影響更小,Vadivelu等[22]認為,FA濃度達到16mgNH3-N/L時對AOB的活性幾乎沒有影響.劉牡[11]采用兩級UASB-A/O工藝處理垃圾滲濾液,在 FA >20mgNH3-N/L的條件下即可實現(xiàn)短程硝化的啟動;吳麗娜等[9]發(fā)現(xiàn)適當?shù)?FA 濃度(40～70mgNH3-N/L)可以實現(xiàn)穩(wěn)定的短程硝化.高濃度的FA條件更有利于AOB,進而實現(xiàn)淘洗NOB實現(xiàn)短程硝化.但FA濃度對NOB活性抑制研究并沒有形成一致的結論,Blackburne等[18]報道當FA為100mgNH3-N/L時,Nitrobacter的活性還高達 70%,這可能是由于所用富含 NOB的污泥生長環(huán)境、污泥濃度等存在差異.

圖3 游離氨(FA)濃度對NOB活性的影響Fig.3 Effect of free ammonia inhibition on NOB activity

2.3 游離亞硝酸(FNA)對NOB活性的影響

圖4顯示了FNA濃度對NOB活性的影響.結果顯示低濃度的FNA(FNA < 0.03mg HNO2-N/L)對 NOB活性具有促進作用:與 FNA 為0.003mg/L相比, FNA為0.005mg/L時NOB的活性提高了 20%;但隨著 FNA濃度的增大(FNA≥0.03mg/L),NOB 的活性也隨之降低,當FNA≥0.2mg/L時,NOB 的活性被完全抑制.采用Aiba等[19]的產(chǎn)物抑制動力學模型(公式 4)對NOB活性與 FNA濃度的結果進行擬合,并計算FNA對NOB的動力學抑制常數(shù)KI,FNA,NOB.獲得的擬合方程為:

其中 Y為 NOB的活性(%),X為 FNA濃度(mgHNO2-N/L),相關性R2=0.96.由擬合結果可計算得到KI,FNA,NOB= 1/10.33= 0.0968mgHNO2-N/L.Vadivelu[22]認為AOB的FNA抑制常數(shù)KI,FNA,AOB在 0.50～0.63mgHNO2-N/L之間.因此,FNA對NOB活性的抑制大于對AOB的抑制.韓曉宇[12]采用 A/O工藝處理消化污泥脫水液,發(fā)現(xiàn)維持FNA > 0.6mgHNO2-N/L可獲得80%以上的亞硝積累率,但當撤去FNA抑制后3d,短程硝化迅速破壞;傅金祥等[10]、劉牡等[11]認為,當FA抑制作用隨著氨氮的氧化而減弱時, FNA的抑制作用(0.09～ 0.4mgHNO2-N/L)是維持短程硝化的重要影響因素.以上結果支持了高FNA濃度下有利于實現(xiàn)短程硝化的結論.

圖4 游離亞硝酸濃度(FNA)對NOB活性的影響Fig.4 Effect of free nitrous acid inhibition on NOB activity

3 結論

3.1 經(jīng)過420d的富集培養(yǎng),NOB富集裝置的污泥中 NOB成為優(yōu)勢菌種.FISH分析結果顯示Nitrobacter占細菌總數(shù)比例為(71±5)%,Nitrospira占細菌總數(shù)比例為(2 ± 1)%.

3.3 FA對NOB活性具有強烈的抑制作用,NOB的活性隨著FA濃度的增大逐漸減小,當FA濃度在10mgNH3-N/L附近時,NOB的活性僅為FA為0時的50%.

3.4 低濃度的FNA(FNA < 0.03mgHNO2-N/L)對 NOB 活性具有促進作用;當 FNA≥0.2mgHNO2-N/L時,NOB的活性被完全抑制;FNA 對 NOB 的 抑 制 常 數(shù) KI,FNA,NOB為0.0968mgHNO2-N/L.

[1]Prosser J I. Autotrophic nitrification in bacteria [J]. Advances in Microbial Physiology, 1990,30:125-181.

[2]Gu S B, Wang S Y, Yang Q, et al. Start up partial nitrification at low temperature with a real-time control strategy based on blower frequency and pH [J]. Bioresource Technology, 2012,112(5):34-41.

[3]Guo J H, Peng Y Z, Huang H J, et al. Short- and long-term effects of temperature on partial nitrification in a sequencing batch reactor treating domestic wastewater [J]. Journal of Hazardous Materials, 2010,179(1-3):471-479.

[4]Yang Q, Peng Y Z, Liu X H, et al. Nitrogen removal via nitrite from municipal wastewater at low temperatures using real-time control to optimize nitrifying communities [J]. Environmental Science and Technology, 2007,41(23):8159-8164.

[5]魏 琛,羅固源.FA和pH值對低C/N污水生物亞硝化的影響[J]. 重慶大學學報, 2006,29(3):124-127.

[6]Guo J H, Peng Y Z, Wang S Y, et al. Long-term effect of dissolved oxygen on partial nitrification performance and microbial community structure [J]. Bioresource Technology, 2009,100(11):2796-2802.

[7]于德爽,殷金蘭,王曉霞,等.控制DO及FA條件下短程硝化過程系統(tǒng)穩(wěn)定性研究 [J]. 環(huán)境工程學報, 2011,5(12):2677-2680.

[8]張 亮,張樹軍,彭永臻.污水處理中游離氨對硝化作用抑制影響研究 [J]. 哈爾濱工業(yè)大學學報, 2012,44(2):75-79.

[9]吳莉娜,彭永臻,王淑瑩,等.游離氨對城市生活垃圾滲濾液短程硝化的影響 [J]. 環(huán)境科學, 2008,29(12):3428-3432.

[10]傅金祥,汪 洋,楊 勇.FA與FNA對A/O工藝短程硝化處理垃圾滲濾液的影響 [J]. 工業(yè)水處理, 2012,32(5):48-51.

[11]劉 牡,彭永臻,吳莉娜,等.FA與FNA對兩級UASB-A/O處理垃圾滲濾液短程硝化的影響 [J]. 化工學報, 2010,61(1):172-179.

[12]韓曉宇,張樹軍,甘一萍,等.以 FA與FNA為控制因子的短程硝化啟動與維持 [J]. 環(huán)境科學, 2009,30(3):809-814.

[13]Anthonisen A, Loehr R, Prakasam T, et al. Inhibition of nitrification by ammonia and nitrous-Acid [J]. Journal Water Pollution Control Federation, 1976,48(5):835-852.

[14]Van H, Volcke E, Teruel J, et al. Influence of temperature and pH on the kinetics of the sharon nitritation Process [J]. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 2007,82(5):471-480.

[15]Prakasam T, Loehr R. Microbial nitrification and denitrification in concentrated wastes [J]. Water Research, 1972,6(7):859-869.

[16]Zhou Y, Adrian O, Melvin L, et al. The role of nitrite and free nitrous acid (FNA)in wastewater treatment plants [J]. Water Research. 2011,45(15):4672-4682.

[17]Vadivelu V M, Yuan Z G, Fux C, et al. Stoichiometric and kinetic characterisation of Nitrobacter in mixed culture by decoupling the growth and energy generation processes [J]. Biotechnology and Bioengineering, 2006,94(6):1176-1188.

[18]Blackburne R, Vadivelu V M, Yuan Z G, et al. Kinetic characterisation of an enriched Nitrospira culture with comparison to Nitrobacter [J]. Water Research, 2007,41(14):3033-304.

[19]Abia S, Sohoda M, Nagatani M. Kinetics of product inhibition in alcohol fermentation [J]. Biotechnology and Bioengineering,1968,10(6):242-248.

[20]APHA. Standard methods for the examination of water and wastewater [D]. American Public Health Association Washington,DC, 1995.

[21]Amann R I, Krumholz L, Stahl D A. Fluorescent- oligonucleotide probing of whole cells for determinative phylogeneric, and environmental-studies in microbiology [J]. Journal of bacteriology, 1990,172(2):762-770.

[22]Vadivelu V M, Keller J, Yuan Z G. Effect of free ammonia and free nitrous acid concentration on the anabolic and catabolic processes of an enriched Nitrosomonas culture [J]. Biotechnology and bioengineering, 2006,95(5):830-839.

致謝：感謝劉麗、董怡君在論文修訂、試驗方面給予的幫助和支持.

Effect of FA and FNA on activity of nitrite-oxidising bacteria.

ZHANG Yu-kun, WANG Shu-ying*, DONG Yi-jun,PENG Yong-zhen (Key Laboratory of Beijing for Water Quality Science and Water Environmental Recovery Engineering,Beijing University of Technology, Beijing 100124, China). China Environmental Science, 2014,34(5)：1242～1247

Nitrite accumulation always accompanies with the nitrification process under the conditions of high concentration of free ammonia (FA) or free nitrous acid (FNA). The impact of FA and FNA concentration on nitrite-oxidising bacteria (NOB) was not clear. In this study, NOB activated sludge was enriched in a lab-scale SBR system with high concentration of nitrite nitrogen wastewater. The fluorescence in situ hybridization (FISH) analysis of NOB-rich sludge showed that Nitrobacter accounted for (71 ± 5)% of total bacteria. The effects of different FA, FNA concentrations on NOB activity were investigated using the sludge. Results showed that NOB activity decreased gradually with the increase of FA concentration. The NOB was still oxidizing nitrite at half of the maximum activity(FA=0mgNH3-N/L)at an FA concentration of 10mgNH3-N/L. Low FNA concentration (FNA < 0.03 mg HNO2-N/L)was beneficial to enhance NOB activity and it was completely restrained when FNA ≥ 0.2mg/L. The inhibition constant of FNA to NOB (KI,FNA,NOB)was 0.0968mg/L with Aiba model. The activity of NOB decreased 50% as the FNA concentration increased from 0.003mg/L to 0.0968mg/L.

activity；free ammonia；free nitrous acid；nitrite-oxidising bacteria；inhibition

X703.1

A

1000-6923(2014)05-1242-06

2013-09-18

高等學校博士學科點專項科研基金(20111103130002);北京市科委科技創(chuàng)新平臺項目

* 責任作者, 教授, wsy@bjut.edu.cn

book=5,ebook=187

張宇坤(1987-),男,黑龍江哈爾濱人,北京工業(yè)大學博士研究生,主要從事污水生物處理方面的研究.發(fā)表論文12篇.