趙江民，劉佳，林雁冰，宗根林，吳利忠，錢海珊，游建雄*

1.上海交通大學醫(yī)學院附屬第三人民醫(yī)院醫(yī)學影像科，上海 201999

2.上海市東方醫(yī)院醫(yī)學影像科，上海200120

骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSCs)是一類具有高度的自我復制能力和多項分化潛能的細胞[1-3]。近年來，隨著分子影像學技術(shù)的發(fā)展，采用適當?shù)姆肿訕擞汢MSCs，利用MRI成像技術(shù)對其示蹤，已成為研究的熱點[4-6]。筆者通過對大鼠BMSCs進行不同濃度超順磁性氧化鐵(SPIO)的體外標記，研究其對干細胞的生物學特性的影響，以及不同標記濃度SPIO的MR成像效果，為進一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要儀器和試劑

清潔級SD大鼠(上海斯萊克實驗動物有限責任公司購入)，4～6周齡5只。

DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)，MR成像儀(3.0 T，Achieva型)(Phillips公司)，F(xiàn)BS(胎牛血清) (美國Gibco公司)，L-谷氨酰胺、青霉素-鏈霉素溶液、胰蛋白酶(1:250) (美國Hyclone公司)，超順磁性氧化鐵(商品名Resovist；德國Schering公司)，普魯士藍染色試劑盒(上海虹橋樂翔醫(yī)用試劑公司)。

1.2 大鼠BMSCs的體外分離、培養(yǎng)與傳代

SD大鼠行頸椎脫臼法處死，完整取出股骨、脛骨及肱骨，在超凈臺無菌條件下，用注射器吸取5 ml含15%胎牛血清的完全培養(yǎng)基(DMEM/F12，青霉素100 U/ml，鏈霉素100 μg/ml)反復沖洗骨髓腔，并用吸管將細胞懸液吹打混勻。將沖出液直接接種于T25的細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

待細胞融合達80%～90% 即可傳代。用0.25%的胰蛋白酶1 ml消化后按1:2或1:3的比例傳代。以后每隔3～4 d換液，倒置相差顯微鏡逐日觀察，待細胞融合鋪滿瓶底約80%～90%，重復上述操作。

1.3 流式細胞儀檢測表面抗原CD34、CD44及CD90

取培養(yǎng)至第4代的細胞，用PE-CD34、PECD44及FITC-CD90抗體標記，并通過流式細胞儀檢測細胞表型。

1.4 BMSCs的SPIO標記及鑒定

SPIO加入到新鮮DMEM/F12(含15%FBS)細胞培養(yǎng)液中，將SPIO濃度分別調(diào)整為25 μg/ml、50 μg/ml、75 μg/ml及100 μg/ml，并在這些液體中分別加入0.75 μg/ml的多聚賴氨酸。實驗組：取狀態(tài)良好的第4代BMSCs分別更換上述4種濃度SPIO的完全培養(yǎng)液，細胞濃度為1×105/ml，置于細胞培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2、濕度95%)孵育48 h，作為實驗組(B、C、D、E)。對照組(A)：用不含SPIOPLL的DMEM/F12培養(yǎng)液換液，其他條件同實驗組。并在倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞的形態(tài)及生長狀況。

將經(jīng)SPIO標記48 h的實驗組(B、C、D、E)的BMSCs分別進行普魯士藍染色，顯微鏡下觀察結(jié)果。計數(shù)陽性細胞，計數(shù)各孔3個低倍鏡視野下的200個細胞中的陽性細胞，計算陽性細胞比率(陽性細胞比率=陽性細胞數(shù)÷細胞總數(shù)×100%)。

1.5 SPIO標記的BMSCs生物學特性的檢測

1.5.1 臺盼蘭染色觀察細胞活性

將實驗組及對照組共5組細胞制為細胞懸液，取9滴細胞懸液移入小試管內(nèi)，加入1滴0.4%的臺盼蘭染液，混勻，在光鏡下進行細胞計數(shù)，死細胞染為藍色，活細胞不著色，計數(shù)200個細胞，每組重復3次，并計算活細胞百分率(活細胞率=活細胞數(shù)÷細胞總數(shù)×100%)。

1.5.2 MTT比色法檢測細胞增殖

將實驗組及對照組共5組細胞制成細胞懸液(細胞濃度2×104/ml)，按每孔200 μl接種于96孔板中，每組設10個平行對照孔。分別在接種后第5天采用MTT法進行細胞增殖檢測，酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔的吸光度值(OD值)。

1.6 SPIO標記的BMSCs體外MRI

對照組、各實驗組標記48 h后，將細胞濃度調(diào)整為2×106/ml的細胞懸液，每組細胞各取250 μl (細胞量為5×105)接種于96孔板中，進行MR掃描。采用Phillips 3.0 T Achieva型MR成像儀，八通道頭顱線圈(Sense head 8 coil)。視野(FOV) 100 mm×150 mm，層厚0.6 mm，層間距0 mm，矩陣163×163；采用3D-FFE (TR 100 ms，TE 4.6～40 ms，echo 5，F(xiàn)lip 15°)。測量各孔細胞懸液圖像的信號強度，ROI為5 mm×5 mm。相對信號值=標記BMSCs的信號強度÷對照的普通BMSCs的信號強度。

1.7 統(tǒng)計學方法

所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析處理，以均數(shù)±標準差(±s)形式表示，細胞活性、細胞增殖結(jié)果及MRI信號強度比較采用方差分析，以P<0.05表示差別有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs表面抗原的檢測

流式細胞儀檢測表面抗原，表面抗原CD34表達陰性，CD44 、CD90表達陽性的細胞分別在98%、90%左右，表明分離培養(yǎng)得到的MSCs純度較高(圖1)。

2.2 SPIO標記BMSCs

2.2.1 倒置相差顯微鏡下，離心后觀察

在倒置相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，SPIO濃度為25 μg/ml、50 μg/ml標記的BMSCs保持原有的梭形形態(tài)，在胞質(zhì)內(nèi)細胞核周圍可見到聚積的褐色顆粒物。但在75 μg/ml及100 μg/ml SPIO標記后的BMSCs中，雖然部分仍保持原有的梭形形態(tài)，但細胞間出現(xiàn)較多的細胞碎片及散在褐色顆粒聚集物，100μg/ml標記的細胞膜模糊、細胞與細胞之間的邊界不清(圖2)。四種濃度SPIO標記48 h后的細胞經(jīng)胰酶消化離心后，可見沉積的細胞團塊呈現(xiàn)為棕褐色，且隨著SPIO的濃度增加其細胞團塊顏色也逐漸加深(圖3)。

2.2.2 標記效率檢測

SPIO濃度為25、50、75及100 μg/ml標記48h的BMSCs經(jīng)普魯士藍染色后顯微鏡下觀察，細胞的胞質(zhì)內(nèi)均出現(xiàn)成簇或散在分布的細小的藍色鐵顆粒，并隨著SPIO濃度的增加，藍色鐵顆粒有所增多。這4個組標記的陽性細胞率分別為：99%、100%、100%、100%(圖4)。

2.3 SPIO標記BMSCs生物學特性的檢測結(jié)果

2.3.1 臺盼蘭染色活細胞計數(shù)

25 μg/ml、50 μg/ml、75 μg/ml、100 μg/ml濃度的SPIO標記后，經(jīng)臺盼蘭染色活細胞比率分別為95.51±1.20、96.03±1.78、92.73±0.98和90.44±2.24，未標記BMSCs活細胞比率為95.35±1.37。與未標記組相比， SPIO濃度為25 μg/ml、50 μg/ml標記的BMSCs活細胞比率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而SPIO濃度為75 μg/ml、100 μg/ml時，活細胞比率差異有統(tǒng)計學意義，P值分別為0.0026、0.0028(P<0.05)，說明對細胞活力有明顯抑制作用。

2.3.2 細胞增殖活性檢測

MTT結(jié)果顯示，濃度為25 μg/ml、50 μg/ml的實驗組SPIO標記對細胞增殖無明顯影響；而濃度為75 μg/ml、100 μg/ml的實驗組與對照組相比，明顯抑制細胞增殖，P值分別為0.01663、0.01659(P<0.05；表1)。

2.4 MRI掃描結(jié)果

表1 實驗組及對照組的MRI信號強度和吸光度(OD)值(±s)Tab.1 MRI signal intensity and absorbance (OD) value of experimental and control groups(±s)

Note: aP<0.05 compared with control group.

Group Signal intensity Absorbance (OD) value (n=10)Control group 1260.2±145.8 0.4886±0.039125 μg/ml 1005.3±262.5 0.4807±0.035250 μg/ml 711.3±198.3a 0.4701±0.033975 μg/ml 556.5±145.6a 0.4523±0.0423a 100 μg/ml 340.4±102.8a 0.4429±0.0309a

在SPIO標記48h的BMSCs MRI掃描圖像上，當SPIO標記濃度為25 μg/ml時，細胞懸液的信號最高，與對照組BMSCs相比較，信號強度的差異無統(tǒng)計學意義；當SPIO濃度≥50 μg/ml，標記細胞的T2信號強度與對照組BMSCs相比較均有明顯差異(P<0.05)，隨著SPIO濃度的增加信號強度也逐漸降低，當濃度為100 μg/ml時，信號強度為最低信號(表1，圖5)。

3 討論

骨髓間充質(zhì)干細胞的標記方法眾多，目前，由于磁對比劑標記細胞進行MRI活體示蹤具有非侵襲性、可重復性、動態(tài)性等特點，故利用MRI定位及監(jiān)測移植細胞遷徙情況已成為重要的研究手段[7-8]。其中，超順磁性氧化鐵(SPIO)也已成為應用最為廣泛的陰性對比劑[9]。

3.1 BMSCs 的SPIO標記

圖1 流式細胞儀檢測MSCs表面抗原CD34、CD44及CD90的結(jié)果 圖2 A為未標記的BMSCs；B～E分別為25 μg/ml、50 μg/ml、75 μg/ml及100 μg/ml SPIO標記48 h的BMSCs ( ×100) 圖3 SPIO標記：不同濃度SPIO標記BMSCs 48 h，離心后細胞的團塊 圖450 μg/ml SPIO標記BMSCs48h后普魯士藍染色(A： ×100；B： ×200) 圖5 不同濃度SPIO (μg/ml)標記BMSCs的MR圖像Fig.1 Detection of MSCs surface antigen CD34, CD44 andCD90 by fl ow cytometry. Fig.2 A: unlabeled BMSCs.B—E: BMSCs labeled with different concentration in 25 μg/ml, 50 μg/ml, 75 μg/ml and 100 μg/ml after 48 h ( ×100). Fig.3 BMSCs labeled with different concentration of SPIO for 48 h after centrifugation. Fig.4 BMSCs labeled with 50 μg/ml SPIO for 48h after the Prussian blue staining (A: ×100.B: × 200). Fig.5 MR images of BMSC labeled with different concentrations of SPIO (μg/ml).

SPIO的核心結(jié)構(gòu)為氧化鐵顆粒(3～5 nm)，其表面帶有負電荷，由于細胞膜也帶負電荷，因此未經(jīng)表面修飾的SPIO納米顆粒很難進入細胞內(nèi)[10-11]。多聚賴氨酸(PLL)(常用轉(zhuǎn)染劑之一)，其表面帶有正電荷，通過靜電作用與表面帶有負電荷的SPIO顆粒結(jié)合，可促進細胞胞吞噬或胞飲，從而提高細胞標記率[12]。本研究采用PLL修飾SPIO，即PLL-SPIO，對干細胞標記的成功率非常高，經(jīng)普魯士藍染色后發(fā)現(xiàn)SPIO濃度分別為25 μg/ml、50 μg/ml、75 μg/ml及100 μg/ml時體外標記BMSCs的細胞陽性率分別為99%、100%、100%、100%。倒置顯微鏡下及細胞離心后觀察，胞質(zhì)內(nèi)細胞核周圍可見到聚積的褐色顆粒物及試管內(nèi)褐色的細胞團塊，且隨著SPIO的濃度增加其細胞團塊顏色也逐漸加深，再次印證了細胞內(nèi)的鐵顆粒濃度與加入培養(yǎng)液內(nèi)的SPIO濃度呈正相關(guān)，這與Daldrup-Link等[13]的結(jié)果一致。

3.2 SPIO標記對BMSCs生物學特性的影響

雖然SPIO的標記濃度越高，細胞的標記率越高，MR成像的效果會越好，但標記濃度過高會影響細胞的生物學活性及其增殖能力[14]，從而影響到活體成像的追蹤觀察；而適宜濃度SPIO標記BMSCs并不影響體外干細胞的生物學特性及多向分化能力[15-16]。因而選擇適宜的標記濃度至關(guān)重要。

本實驗結(jié)果顯示，SPIO濃度為25 μg/ml、50 μg/ml的SPIO標記后的BMSCs生長狀態(tài)良好，能夠保持細胞原有的梭形形態(tài)，正常貼壁生長并傳代，臺盼蘭活細胞計數(shù)實驗及MTT細胞增殖檢測證實標記后的細胞仍具有較高的活性及增殖能力。以上實驗結(jié)果與Arbab等[17]及Ben-Hur等[18]研究結(jié)果相似。而當SPIO濃度為75 μg/ml和100 μg/ml時，活細胞率分別為92.70%和90.41%，明顯低于對照組，且細胞增殖明顯受到抑制，說明當SPIO濃度過高時會對細胞產(chǎn)生一定的毒性作用。這可能與細胞內(nèi)非結(jié)合的鐵能使氧化作用加強，形成過多的氧化產(chǎn)物和羥基自由基，造成細胞損傷，甚至導致細胞壞死有關(guān)[19]。

3.3 體外MRI成像

經(jīng)SPIO標記BMSCs的MRI成像觀察，證實SPIO主要縮短了T2*及T2弛豫時間，1×103/ml的細胞濃度就能引起明顯的信號變化[20]，且經(jīng)表面轉(zhuǎn)染的SPIO標記是觀察所標記干細胞的最有效方法[16]。在本研究MRI上，觀察到SPIO標記48 h的各組細胞懸液的信號強度，與未標記對照組BMSCs相比較，均表現(xiàn)為不同程度的低信號，但SPIO標記濃度為25 μg/ml時，與普通BMSCs相比較，信號強度的差異無統(tǒng)計學意義；當SPIO濃度≥50 μg/ml時，標記細胞的T2信號強度與普通BMSCs相比較均有明顯差異(P<0.05)，隨著SPIO濃度的增加信號強度也逐漸降低，這也說明隨著SPIO標記濃度的增加，進入到細胞內(nèi)的SPIO也有所增加，產(chǎn)生了更為明顯的負性對比效應，這與Lee等[21]報道一致。

本研究標記方法簡單易行且安全有效，同時MRI能夠探測到干細胞在活體內(nèi)的分布和遷移[15]。但該方法還存在不足之處：由于MRI只能觀察標記細胞的鐵含量變化，故只能對標記細胞起示蹤依據(jù)，不能對標記細胞的定量和定性分析，無法分析細胞的增殖及分化情況，所以影響以后干細胞在體內(nèi)移植后的觀察價值。相信分子影像技術(shù)的運用和標記方法的改進是未來研究的方向。另外Rosenberg等[22]發(fā)現(xiàn)SPIO標記hMSCs在缺血缺氧環(huán)境下其細胞活性大幅降低，所以該標記方法運用于腦缺血動物模型的影響，有待更多的試驗證實。同時，王建東等[23]發(fā)現(xiàn)鐵蛋白與SPIO相互作用，并可以延長MRI活體細胞示蹤時間，克服了SPIO無法長期標記示蹤的缺陷。

總之，本研究通過全骨髓直接貼壁法能在體外成功培養(yǎng)并擴增出大鼠BMSCs，經(jīng)形態(tài)學、分化潛能及流式細胞儀鑒定證實；采用濃度為25～50 μg/ml的SPIO聯(lián)合0.75 μg/ml PLL體外標記大鼠BMSCs安全、可靠，不會對細胞的表型、活力和增殖等生物學特性產(chǎn)生明顯的影響；MR掃描在T2WI序列上能有效觀察到濃度為50 μg/ml標記SPIO標記BMSCs 48 h后的信號變化。

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