江偉敏，姚余有

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，安徽合肥 230032;2.安徽省阜陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽阜陽 236000)

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染是宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)和宮頸癌的主要致病原因［1］。研究表明高危型HPV的E6/E7是病毒致癌基因，其產(chǎn)物可抑制抑癌基因p53及視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(pRb)，促進(jìn)細(xì)胞無規(guī)則生長(zhǎng)，參與宮頸癌的發(fā)生［2］，但有關(guān)宮頸組織標(biāo)本病理分級(jí)與HPV E6/E7 mRNA表達(dá)之間的關(guān)系研究較少。本研究擬利用安徽省阜陽市某三級(jí)甲等醫(yī)院婦科病人采用先進(jìn)的支鏈 DNA(bDNA)技術(shù)，研究宮頸組織標(biāo)本病理分級(jí)與HPV E6/E7 mRNA表達(dá)之間的關(guān)系，為早期干預(yù)宮頸疾病提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象 對(duì)象為2012年9至2013年11月安徽省阜陽市人民醫(yī)院婦科門診病例，經(jīng)宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查不能確診同時(shí)懷疑宮頸病變的女性患者，行陰道鏡檢測(cè)，并進(jìn)行宮頸組織活檢，一部分活檢組織進(jìn)行病理診斷，一部分凍存于液氮中，用于RNA的提取。

1.2 材料 組織裂解劑(溶解液與蛋白酶 K按1∶800混合)、檢測(cè)探針和反應(yīng)液均購(gòu)自Diacarta公司;96孔HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)板購(gòu)自河南科蒂亞(新鄉(xiāng))生物技術(shù)有限公司。檢測(cè)使用的冷光儀為QuantiVirusTM冷光儀(Diacarta)。

1.3 宮頸細(xì)胞病理學(xué)診斷 宮頸組織取材包括陰道鏡直接活檢，定點(diǎn)四象限活檢和子宮頸管刮取活檢。取材后用10%中性甲醛固定16～24 h，然后將標(biāo)本放入70%酒精中保存，石蠟包埋、切片，常規(guī)HE染色，常規(guī)封片，根據(jù)病理診斷標(biāo)準(zhǔn)閱片。將組織標(biāo)本分為宮頸炎、輕度宮頸上皮內(nèi)瘤變(CINⅠ)、中度宮頸上皮內(nèi)瘤變(CINⅡ)、重度宮頸上皮內(nèi)瘤變(CINⅢ)和宮頸癌。

1.4 HPV E6/E7 mRNA檢測(cè) 活檢組織粉碎后加入裂解劑，65℃ 水浴30 min，得到裂解液。按說明書配置相關(guān)溶液并進(jìn)行操作，經(jīng)過信號(hào)放大、加入標(biāo)記熒光物質(zhì)的底物后，在QuantiVirusTM冷光儀上檢測(cè)。陽性對(duì)照、空白對(duì)照均為復(fù)孔，所有標(biāo)本均檢測(cè)兩次取均值［3］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。不同程度宮頸病變中HPV E6/E7 mRNA的表達(dá)率比較采用χ2檢驗(yàn)/Fisher精確檢驗(yàn);不同病理分級(jí)宮頸組織標(biāo)本HPV E6/E7 mRNA的表達(dá)量差異采用成組設(shè)計(jì)多個(gè)樣本比較的秩和檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis法);宮頸組織標(biāo)本病理分級(jí)與HPV E6/E7 mRNA表達(dá)量的相關(guān)性研究采用秩相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 病理診斷結(jié)果 在檢測(cè)的226例宮頸組織中，宮頸炎153例，CINⅠ22例，CINⅡ15例，CINⅢ17例，宮頸癌19例。

2.2 不同病理分級(jí)的宮頸組織標(biāo)本HPV E6/E7 mRNA的表達(dá)率 226例宮頸組織標(biāo)本中，檢測(cè)出HPV E6/E7 mRNA陽性標(biāo)本 56例，陽性率 24.8%。其中宮頸炎組 9例(5.9%)，CINⅠ組12 例(54.5%)，CINⅡ組10 例(66.7%)，CINⅢ組12例(70.6%)，宮頸癌組13例(68.4%)(表1)。χ2檢驗(yàn)顯示，各組間差異有顯著性。進(jìn)一步的χ2分割檢驗(yàn)顯示，宮頸炎組HPV E6/E7 mRNA陽性表達(dá)率顯著低于CIN組及宮頸癌組(P＜0.01);而CIN組之間、CIN與宮頸癌組之間的HPV E6/E7 mRNA陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 不同病理分級(jí)的宮頸組織標(biāo)本HPV E6/E7 mRNA的表達(dá)陽性率

2.3 不同病理分級(jí)的宮頸組織標(biāo)本HPV E6/E7 mRNA表達(dá)量 為了了解HPV E6/E7 mRNA表達(dá)量(copies/ml)與宮頸組織病理分級(jí)是否存在相關(guān)，我們采用冷光儀對(duì)HPV E6/E7 mRNA表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表2。多組秩和檢驗(yàn)結(jié)果顯示，不同病理分級(jí)的宮頸組織標(biāo)本HPV E6/E7 mRNA表達(dá)量差異有顯著性(H=111.362，P＜0.01)。秩相關(guān)分析顯示，宮頸組織標(biāo)本病理分級(jí)與HPV E6/E7 mRNA表達(dá)量成正相關(guān)(rs=0.7，P ＜0.01)。

表2 不同病理分級(jí)的宮頸組織標(biāo)本HPV E6/E7 mRNA的表達(dá)量

3 討論

HPV感染后可在體內(nèi)長(zhǎng)期處于潛伏狀態(tài)，在出現(xiàn)機(jī)體免疫力降低等誘發(fā)因素時(shí)，潛伏的HPV可恢復(fù)增殖。研究發(fā)現(xiàn)，HPV的感染過程通?？煞譃闈摲腥酒凇喤R床感染期、臨床癥狀期和HPV相關(guān)的腫瘤期，并且99.7%的宮頸癌患者均具有HPV的感染［4－5］。CIN是與宮頸浸潤(rùn)癌密切相關(guān)的一組癌前病變，反映了宮頸癌發(fā)生發(fā)展的連續(xù)過程，HPV感染是CIN發(fā)生的重要原因，也是CIN進(jìn)展為宮頸癌的重要誘因［6］。

HPV基因組學(xué)研究顯示，HPV編碼包括6個(gè)早期開放讀碼框(E1，E2，E4，E5，E6 和 E7)及 2 個(gè)晚期讀碼框(L1 和L2)。HPV感染后首先潛伏于基底細(xì)胞層，其DNA可作為獨(dú)立的外源染色體進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，整合至正常細(xì)胞的基因組當(dāng)中，并且利用細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄翻譯機(jī)制表達(dá)了兩種有害的病毒蛋白E6和E7蛋白。這兩種蛋白都能夠與兩種非常重要的抑癌蛋白p53蛋白和pRb蛋白結(jié)合，減低這兩種抑癌蛋白的活性。p53蛋白能夠在細(xì)胞DNA出現(xiàn)損傷時(shí)抑制細(xì)胞繼續(xù)分裂，啟動(dòng)DNA修復(fù)機(jī)制對(duì)損傷進(jìn)行修復(fù)，或者直接促使細(xì)胞凋亡。但在p53蛋白活性減低后，極大的增加了細(xì)胞出現(xiàn)突變的風(fēng)險(xiǎn)。pRb蛋白能夠抑制細(xì)胞過度生長(zhǎng)，在活性減低后，細(xì)胞的增殖將會(huì)失控［7－8］。

目前廣泛應(yīng)用的HPV DNA檢測(cè)是病因?qū)W檢測(cè)，無法體現(xiàn)宮頸細(xì)胞內(nèi)HPV病毒載量、病毒整合程度，也無法明確HPV的致癌基因是否發(fā)揮作用［9］。在宿主細(xì)胞中，無論HPV處于游離狀態(tài)或整合狀態(tài)，致癌基因E6和E7要發(fā)揮作用，必須進(jìn)行mRNA的轉(zhuǎn)錄。因此，E6/E7 mRNA的檢測(cè)可用于評(píng)價(jià)宮頸細(xì)胞的異常轉(zhuǎn)化［10－11］。

bDNA技術(shù)是一種新型的核酸雜交方法，在我國(guó)僅較少實(shí)驗(yàn)室從美國(guó)引進(jìn)，該方法采用bDNA分子放大捕獲的目標(biāo)DNA/RNA信號(hào)，因此無需PCR擴(kuò)增過程，放大倍數(shù)精確，重復(fù)性、穩(wěn)定性高，可以準(zhǔn)確定量檢測(cè)DNA/RNA。與常規(guī)實(shí)時(shí)PCR技術(shù)相比，bDNA技術(shù)無需抽提純化DNA/RNA，無需反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，只要將樣本用特定裂解液裂解后，經(jīng)探針雜交與信號(hào)放大即可快速得到準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果［12］。

本研究采用bDNA技術(shù)檢測(cè)了宮頸炎、CIN和宮頸癌患者宮頸組織中HPV E6/E7 mRNA的表達(dá)，在不同病理級(jí)別的患者中均發(fā)現(xiàn)了陽性表達(dá)。統(tǒng)計(jì)表明，宮頸炎組的陽性表達(dá)率顯著低于CIN組及宮頸癌組;在CIN和宮頸癌中，隨著細(xì)胞學(xué)病變程度的增高，陽性表達(dá)率出現(xiàn)了上升趨勢(shì)。HPV E6/E7 mRNA表達(dá)量的檢測(cè)結(jié)果表明，不同病理分級(jí)的宮頸組織標(biāo)本HPV E6/E7 mRNA表達(dá)量差異有顯著性，宮頸組織標(biāo)本病理分級(jí)與HPV E6/E7 mRNA表達(dá)量成正相關(guān)。提示，HPV E6/E7 mRNA是宮頸細(xì)胞癌變的重要因素。因此，對(duì)HPV E6/E7 mRNA表達(dá)量的定量檢測(cè)，對(duì)于及時(shí)干預(yù)宮頸病變的發(fā)展、協(xié)助臨床診斷、宮頸癌的分型及預(yù)后均具有重要的指導(dǎo)意義。

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