孫海峰

黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司雞西分公司

八角蓮中鬼臼毒素的含量測(cè)定技術(shù)

孫海峰

黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司雞西分公司

目的：建立高效液相色譜法測(cè)定八角蓮中鬼臼毒素含量的方法。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱為Diamonsiltm C18柱；流動(dòng)相：甲醇-0.1mol/L磷酸二氫鉀水溶液（50∶50）；流速：1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：290nm。結(jié)果：鬼臼毒素在0.04769～0.4769mg/ml呈良好線性關(guān)系（r=0.9996），平均回收率為99.94%，RSD=1.71%（n=5）。結(jié)論：采用高效液相色譜法測(cè)定八角蓮中鬼臼毒素的含量，操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，專(zhuān)屬性強(qiáng)。

八角蓮；鬼臼毒素；含量測(cè)定

八角蓮為小檗科植物八角蓮Dysosma versipellis（Hance．）M．cheng（Podophyllum versipelle Hance．）的根及根莖。具有清熱解毒、化痰散結(jié)、祛痰消腫之功能。用于癰腫疔瘡、瘰疬、咽喉腫痛、跌打損傷、毒蛇咬傷等。筆者曾對(duì)八角蓮的性狀、顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行過(guò)研究［1］。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法測(cè)定八角蓮中鬼臼毒素的含量，為完善八角蓮藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1、儀器與試藥

1.1 儀器

戴安UltiMateTM3000型高效液相色譜儀，包括四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外檢測(cè)器、變色龍（chromeleon）軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；島津AUW120D分析天平（d＝0．1mg/0．01mg）；UP5200H超聲波清洗器（熊貓集團(tuán)南京 電子 計(jì)量有限公司）。

1.2 試藥

甲醇為色譜純（中國(guó)上海陸都化學(xué)試劑廠）；磷酸二氫鉀為分析純。鬼臼毒素對(duì)照品（含量測(cè)定用，以93．5%計(jì)，批號(hào)111645-200301）由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；八角蓮Dysosma versipellis（Hance．）M．Cheng（Podophyllum versipelle Hance．），由中南民族大學(xué)萬(wàn)定榮教授鑒定和提供。

2、方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Diamonsiltm C18色譜柱（250mm×4．6mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇-0．1mol/L磷酸二氫鉀（50∶50）；檢測(cè)波長(zhǎng)290nm；流速1．0ml/ min；柱溫30℃；靈敏度：0．1AUFS；理論塔板數(shù)按鬼臼毒素峰計(jì)算不低于1500。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取在五氧化二磷干燥器中減壓干燥12h的鬼臼毒素對(duì)照品適量，加甲醇制成每毫升約含0．5mg的溶液，搖勻，微孔濾膜過(guò)濾（0．45μm），得鬼臼毒素對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

分別取八角蓮根莖和根粉末（過(guò)3號(hào)篩）各約0．5g，精密稱(chēng)取，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，放置12h，稱(chēng)定重量，超聲處理30min，取出，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，微孔濾膜過(guò)濾（0．45μm），得八角蓮根莖和根的供試品溶液。

2.4 八角蓮根莖和根HPLC譜圖比較

分別取八角蓮根莖和根供試品溶液10μl，注入高效液相色譜儀中，對(duì)其HPLC圖進(jìn)行比較，比較可以看出，八角蓮根中基本不含鬼臼毒素成分。

2.5 線性關(guān)系考察

精密稱(chēng)取在五氧化二磷干燥器中減壓干燥12h的鬼臼毒素對(duì)照品25．5mg，置50ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻（0．51×93．5%＝0．4769mg/ml），精密量取溶液1．0，2．0，3．0，4．0，5．0ml，分別置10ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，鬼臼毒素含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算回歸方程為：Y=0．01108X＋8．6782×10-3，r=0．9996。結(jié)果表明，鬼臼毒素的進(jìn)樣量在0．04769～0．4769mg/ml的范圍內(nèi)，濃度與峰面積呈良好。

2.6 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取鬼臼毒素對(duì)照品溶液10μl，按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次，依次測(cè)定各峰的峰面積值，結(jié)果鬼臼毒素對(duì)照品RSD=0．24%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取密封室溫保存的八角蓮根莖供試品溶液10μl，分別于0，2，5，8，10h進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積值，計(jì)算RSD=0．84%（n=3），結(jié)果表明，供試品溶液在10h內(nèi)檢測(cè)對(duì)結(jié)果無(wú)影響，穩(wěn)定性良好。

2.8 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取同一批八角蓮根莖樣品，按供試品溶液制備方法平行制備5份供試液，分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl，測(cè)定5份供試品中鬼臼毒素的含量，結(jié)果RSD=1．50%。

2.9 樣品測(cè)定

取3批八角蓮根莖樣品，按供試品溶液制備方法操作，分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，用外標(biāo)法測(cè)定，計(jì)算樣品中鬼臼毒素的含量。

2.10 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取已知含量的八角蓮根莖樣品5份，各約0．25g，精密稱(chēng)定，分別加入鬼臼毒素對(duì)照品2．55mg（2．55×93．5%＝2．3843mg），按供試品溶液制備方法操作，照上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為99．94%，RSD=1．71%。

3、討論

3.1 八角蓮中鬼臼毒素的含量與提取方法有關(guān)

八角蓮的有效成分為鬼臼毒素，有文獻(xiàn)報(bào)道八角蓮經(jīng)80%甲醇超聲提取，測(cè)得鬼臼毒素的含量為0．94%，采用文中所用的甲醇超聲提取測(cè)得鬼臼毒素的含量為1．01%，結(jié)果表明，八角蓮中鬼臼毒素的含量可能與提取溶劑、方法等有一定關(guān)系，值得進(jìn)一步研究。

3.2 八角蓮根中基本不含鬼臼毒素

通過(guò)比較八角蓮根與根莖的HPLC圖可以看出，八角蓮根中基本不含鬼臼毒素，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，主要是八角蓮的根莖具有鬼臼毒素的抗癌抗病毒活性。

本法測(cè)定八角蓮中鬼臼毒素的含量，樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單，有效成分分離良好，而且無(wú)其他成分干擾，對(duì)八角蓮藥材的質(zhì)量控制有一定的參考價(jià)值。

[1]陳黎,涂自良,陳吉炎.高效液相色譜法測(cè)定八角蓮中鬼臼毒素的含量.論文網(wǎng),2011.08