耿廣琴，楊雅麗，王 晶，黃 勇

(甘肅中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000)

衰老是一個(gè)復(fù)雜的多環(huán)節(jié)生物學(xué)過程，是生物界普遍存在的一種自然現(xiàn)象，是一切多細(xì)胞生物隨著時(shí)間的推移而表現(xiàn)出的各個(gè)細(xì)胞和器官功能的不可逆地、全面地、逐漸地喪失［1］。衰老雖不可逆轉(zhuǎn)，但可以緩解［2］。當(dāng)今世界人口老齡化問題日趨嚴(yán)重，我國老齡化問題尤為嚴(yán)峻。面對衰老帶來的諸多社會、生活問題，開展老年醫(yī)學(xué)及老年生物學(xué)方面的研究，探討延緩衰老的方法，成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)之一。甘肅道地中草藥黨參具有補(bǔ)中、益氣、生津之功效。研究報(bào)道顯示:注射或服用黨參水提物可以增強(qiáng)體質(zhì)，提高人體免疫力，延緩衰老［3－4］。本實(shí)驗(yàn)以D－半乳糖建立致衰老小鼠模型，研究黨參水提物對衰老模型小鼠肝腎SOD活性、MDA含量和超微結(jié)構(gòu)的影響，旨在探討中藥黨參保肝護(hù)腎抗衰老的機(jī)制，以使其更好地發(fā)揮藥用價(jià)值，同時(shí)為中醫(yī)藥延緩衰老機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

PF級昆明種小鼠100只，2月齡，雌雄各半，體質(zhì)量(18±2)g，購自甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號:SCXK(甘)2011－0001。

1.2 藥品、試劑與儀器

黨參，采自甘肅岷縣，經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)教研室鑒定為白條黨參。取黨參100 g，分2次煎煮，第1次加10倍量水煎煮1 h，第2次加6倍水煎煮1 h，合并兩次提取液，過濾后，濃縮成含生藥0.5 g/mL的水煎劑，置4℃冰箱備用，水煎液每5 d制備1次。D－半乳糖，美國Sigma公司產(chǎn)品，臨用前用生理鹽水配制成12 g/L，備用;考馬斯亮藍(lán)測定試劑盒(批號20130819)、丙二醛(MDA)試劑盒(批號20130726)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號20130726)，均購自南京建成生物工程研究所。BS224S型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;HH－4數(shù)顯恒溫水浴鍋，鄭州杜甫儀器廠產(chǎn)品;XYJ80－20型離心機(jī)，金壇市恒豐儀器廠產(chǎn)品;XW－80A型旋渦混勻器，上海精科實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品;VIS－723N型紫外可見分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器有限公司產(chǎn)品;JEOL－1230透射電子顯微鏡，日本電子公司產(chǎn)品。

1.3 動(dòng)物分組及模型的建立

將100只小鼠，隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組和黨參水提物低、中、高劑量組5組，每組20只，雌雄各半。模型對照組、黨參水提物各劑量組每日每只小鼠頸背部皮下注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)50 g/L的 D－半乳糖溶液，注射量為0.025 mL/g，正常對照組注射等體積量生理鹽水。采用灌胃給藥法，黨參水提物低、中、高劑量組每日上午按相當(dāng)于生藥量5，10，15 g/kg劑量給藥，正常對照組、模型對照組灌服等體積生理鹽水，與造模同步，連續(xù)42 d。

1.4 檢測指標(biāo)

于末次給藥2 h后，稱量各組小鼠體質(zhì)量;斷頭處死小鼠，迅速剖取胸腺、脾、肝、腎，用預(yù)冷的4℃生理鹽水洗凈表面殘血，備用。

1.4.1 胸腺、脾臟指數(shù)

將胸腺、脾臟用濾紙吸干，電子天平稱量質(zhì)量，臟器指數(shù)=內(nèi)臟質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.4.2 SOD 活性、MDA 含量

分別取大鼠肝、腎組織塊約0.3 g，用預(yù)冷的生理鹽水制備成100 g/L的肝勻漿和腎勻漿，3 000 r/min離心5 min，上清液 －20℃凍存，用于SOD活性、MDA含量測定。SOD活性測定采用黃嘌呤氧化酶法，MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法(TBA)法，組織蛋白含量的測定采用考馬斯亮蘭法。具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.3 超微結(jié)構(gòu)觀察

取大鼠肝及腎皮質(zhì)組織結(jié)構(gòu)1 mm3，分別固定于1/15 mol/L磷酸緩沖液(PBS)配制的30 g/L戊二醛固定液中2 h;PBS液漂洗3次，每次10 min;10 g/L鋨酸固定 1.5 h;PBS液漂洗 3次，每次10 min;500，700，800，900，1000 g/L 乙醇梯度脫水，每次10 min;純丙酮脫水2次，每次10 min;EPON-812環(huán)氧樹脂∶純丙酮(1∶1)浸透2 h;EPON-812環(huán)氧樹脂包埋;聚合(35℃ 24 h，45℃ 24 h，65℃24 h);半薄切片，甲苯胺藍(lán)染色，光鏡下定位;超薄切片，透射電子顯微鏡觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差(mean±SDs)表示，組間比較采用one-way ANOVA分析。以P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠胸腺、脾臟指數(shù)對比

與正常對照組對比，模型對照組胸腺指數(shù)下降，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與模型對照組對比，黨參水提物3個(gè)劑量組胸腺指數(shù)增高，但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與正常對照組對比，模型對照組脾臟指數(shù)降低，但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與模型對照組對比，黨參水提物3個(gè)劑量組脾臟指數(shù)均升高，但差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 各組小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)對比 mean±SDs

2.2 各組小鼠肝、腎SOD活力及MDA含量對比

正常對照組肝臟中SOD活性顯著高于模型對照組(P＜0.01)，黨參水提物低、中、高劑量組肝臟中SOD活性均高于模型對照組，其中高劑量組肝臟中SOD活性較之差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。正常對照組腎臟中SOD活性顯著高于模型對照組(P＜0.01);黨參水提物低、中、高劑量組腎臟中SOD活性均高于模型對照組，其中中、高劑量組腎臟中SOD活性較之差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。與模型對照組小鼠對比，正常對照組和黨參水提物低、中、高劑量組小鼠肝臟組織中MDA含量均降低，其中正常對照組、高劑量組較之差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型對照組對比，正常對照組和黨參水提物低、中、高劑量組小鼠腎臟組織中MDA含量均降低，其中正常對照組、黨參水提物中、高劑量組較之差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P ＜0.01)。見表2。

表2 各組小鼠肝、腎中SOD活力、MDA含量對比 mean±SDs

2.3 各組小鼠肝、腎超微結(jié)構(gòu)對比

肝臟超微結(jié)構(gòu)變化見圖1。正常對照組肝細(xì)胞核呈橢圓形，核膜平整光滑，核周少量異染色質(zhì)，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、核糖體等結(jié)構(gòu)正常。模型對照組肝細(xì)胞核體積相對于正常略有縮小，核異染色質(zhì)增多，胞質(zhì)內(nèi)局部細(xì)胞器線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量明顯減少，殘留較多糖原顆粒，及少量脂滴，并可見部分胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹。黨參水提物低劑量組肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)部分線粒體腫脹。黨參水提物中劑量組肝細(xì)胞核形態(tài)正常，胞質(zhì)內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕中度擴(kuò)張。黨參水提物高劑量組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常。

腎臟超微結(jié)構(gòu)變化見圖2。正常對照組腎近曲小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)、胞質(zhì)內(nèi)線粒體正常，游離面致密，微絨毛結(jié)構(gòu)排列整齊。模型對照組腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹、體積增大，線粒體嵴溶解，減少。黨參水提物低劑量組腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)細(xì)胞器腫脹，游離面微絨毛稀疏、脫落或完全消失。黨參水提物中劑量組腎小球內(nèi)部分毛細(xì)血管節(jié)段系膜細(xì)胞、系膜基質(zhì)輕度增生，但程度明顯輕于模型對照組，足細(xì)胞足突結(jié)構(gòu)基本正常。黨參水提物高劑量組大部分腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常，僅見少量線粒體腫脹。

圖1 各組小鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)(×10 000)

圖2 各組小鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)(×10 000)

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為:衰老是整體性的、退行性的變化過程，而五臟虛損是衰老整體變化中的核心部分。隨著年齡增長，機(jī)體五臟逐漸虛損，最終五臟皆虛，而盡終其天年。五臟虛損不僅是衰老的特征表現(xiàn)，也是導(dǎo)致衰老的重要原因［5］。五臟之中，腎與衰老的關(guān)系最為密切［6］，肝與衰老的關(guān)系也非常明朗［7］?！澳I元盛則壽延，腎元衰則壽夭”(《醫(yī)學(xué)正傳》)，人體衰老與否，以及衰老的速度、衰老的程度、壽命的長短主要取決于腎氣的強(qiáng)弱。肝與衰老的關(guān)系始載于《靈樞·天年》，曰:“五十歲，肝氣始衰，肝葉始薄，膽汁始滅，目始不明……”此明確提出了肝在衰老過程中居于先導(dǎo)地位［8］。本研究結(jié)果顯示:模型對照組肝、腎中SOD活性明顯下降，MDA含量升高，胸腺指數(shù)下降，符合衰老的一些病理學(xué)特征［9－10］，表明本實(shí)驗(yàn)衰老模型的建立是成功的。給予動(dòng)物模型黨參水提物后，可阻止衰老的發(fā)展，其中黨參水提物高劑量組諸指標(biāo)基本恢復(fù)或接近正常水平，表明:黨參可以通過提高肝、腎SOD活性，顯著降低體內(nèi)MDA含量，減輕脂質(zhì)過氧化對機(jī)體造成的損傷，對延緩衰老能起到了積極作用。

電鏡觀察結(jié)果表明:與正常對照組對比，模型對照組肝臟超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了明顯異常改變，主要表現(xiàn)為細(xì)胞核體積相對縮小，胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量明顯減少。給予黨參水提物后，中劑量組肝臟超微結(jié)構(gòu)明顯改善，高劑量組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常。與正常對照組對比，模型對照組腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹，嵴溶解、減少。給予黨參水提物后，中、高劑量組腎臟超微結(jié)構(gòu)的異常變化明顯緩解。線粒體是細(xì)胞內(nèi)能量合成的主要場所，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)的合成與加工的部位，細(xì)胞作為生物體結(jié)構(gòu)與功能的基本單位，只有保持其完整性，才能正常完成各項(xiàng)生命活動(dòng)?？梢婞h參可以抑制衰老導(dǎo)致的小鼠肝、腎組織超微結(jié)構(gòu)的異常變化，對維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性、維持細(xì)胞正常生理功能起到了重要的作用。從衰老致小鼠肝、腎超微結(jié)構(gòu)的變化程度來看，腎臟的損傷程度明顯大于肝臟的損傷程度、這與肝、腎中SOD活性、MDA含量的變化一致，這或許是因?yàn)?，相對于腎臟，肝臟自我修復(fù)和代償能力較強(qiáng)。

綜上所述，黨參水提物可增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，減輕脂質(zhì)過氧化對機(jī)體造成的損傷，延緩肝、腎細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化，具有保肝護(hù)腎，減慢衰老進(jìn)程的作用，其中高劑量的效果更為理想。

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