劉佳鑫　侯和勝

摘 要：NAC基因家族是高等植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，廣泛參與植物生長發(fā)育、逆境脅迫應(yīng)答等反應(yīng)。通過對71種葡萄NAC蛋白與22種其他物種NAC蛋白的生物信息學(xué)分析，對與非生物逆境脅迫相關(guān)的12種NAC蛋白的染色體定位、理化性質(zhì)、親/疏水性、二級結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位等進(jìn)行了分析和預(yù)測。結(jié)果顯示，葡萄NAC蛋白共分為5大類，與非生物逆境相關(guān)的NAC蛋白聚集在第Ⅲ類。分析顯示不同NAC蛋白間氨基酸、疏水性及穩(wěn)定性之間存在一定差異，二級結(jié)構(gòu)主要為隨機(jī)卷曲等。分析結(jié)果可為進(jìn)一步研究通過葡萄NAC基因調(diào)控葡萄的生長與抗逆機(jī)制提供參考。

關(guān)鍵詞：葡萄；非生物脅迫；NAC轉(zhuǎn)錄因子；生物信息學(xué)

中圖分類號： 5663.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.05.008

提高葡萄對非生物脅迫的耐受性對提高葡萄的產(chǎn)量具有重要作用。很多轉(zhuǎn)錄因子在改進(jìn)植物脅迫耐受性方面發(fā)揮著重要作用[1-2]。NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類蛋白家族，諸多研究顯示[3-5]，NAC家族成員能夠激活非生物脅迫相應(yīng)基因，提高植物對非生物脅迫的耐受性[6-7]。Fang等[8]系統(tǒng)地分析了水稻中的140個NAC或NAC類基因，并將其劃分為5大組，逆境脅迫相關(guān)的NAC聚在第3組。本研究利用生物信息學(xué)的方法從葡萄基因組水平上對NAC基因家族進(jìn)行分類，并對與非生物脅迫相關(guān)的NAC基因進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步研究葡萄NAC類轉(zhuǎn)錄因子提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

通過北京大學(xué)植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫（TFDB， http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）獲得其中收錄的71條葡萄NAC基因，依次命名為VvNAC1-71。通過美國生物信息技術(shù)中心（NCBI，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索相應(yīng)資料。獲得已發(fā)表的其它物種的NAC蛋白作為參考標(biāo)準(zhǔn)，包括16種逆境脅迫基因（ATAF1， CsNAC， GmNAC2， RD26， ANAC055， ANAC019， AhNAC2， AhNAC3， AmNAC1， SsNAC23， SNAC1， SNAC2， TaNAC3， ZmNAC1， OsNAC6， StNAC）和6種生長發(fā)育相關(guān)基因（OsNAC7， NAC1， CUC3 NAM， GRAB2， NAC2）。

1.2 方 法

1.2.1 NAC蛋白氨基酸序列比對及系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建 利用clustal軟件進(jìn)行氨基酸多重序列比對，利用MEGA4中遺傳距離建樹法的相鄰鏈接法（NJ）進(jìn)行建樹，對生成的進(jìn)化樹進(jìn)行Bootstrap（自引導(dǎo)）校正，生成系統(tǒng)發(fā)生樹。

1.2.2 NAC基因結(jié)構(gòu)分析及染色體定位 通過葡萄基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.phytozome.net/cgi-bin/gbrowse/grape）進(jìn)行染色體定位，在NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）中搜索保守結(jié)構(gòu)域。

1.2.3 NAC基因一級結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)分析 利用ExPaSy提供的ProtParam程序（http：//web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行理化性質(zhì)分析。利用ProtScale程序（http：//us.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）對翻譯后的氨基酸序列做疏水性分析。磷酸化和去磷酸化是細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的重要方式，利用NetPhos2.0 Server程序（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）做磷酸化位點(diǎn)分析，對蛋白序列中的絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）3種氨基酸殘基可能形成的磷酸化位點(diǎn)作出預(yù)測。

1.2.4 二級結(jié)構(gòu)分析及亞細(xì)胞定位 運(yùn)用PBIL LYON-GERLAND信息庫（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa automat.pl page=/NPSA/npsa_hnn.html）對蛋白質(zhì)序列進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測（Secondary structure prediction）。通過WoLF PSORT工具（http：//wolfpsort.seq.cbrc.jp/）基于其氨基酸序列預(yù)測蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)發(fā)生樹

通過系統(tǒng)進(jìn)化分析，葡萄NAC轉(zhuǎn)錄因子家族共分5個大類（圖1），每大類也各有不同。第Ⅰ大類包含17個葡萄NAC基因，在6種發(fā)育相關(guān)的NAC基因中，除擬南芥NAC2[9]基因位于第Ⅵ大類外全部位于第Ⅰ大類，推斷第Ⅰ大類NAC基因與葡萄的生長發(fā)育相關(guān)。非生物逆境脅迫相關(guān)NAC基因全部位于第Ⅲ大類，位于此類的葡萄NAC基因共有12個，其中VvNAC45與VvNAC56兩個基因同源性相對較低。其余NAC基因位于第Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ大類。其中第Ⅳ大類NAC基因數(shù)量最多。推測擬南芥NAC2基因位于第Ⅳ大類的原因可能是其序列特異性不強(qiáng)或參與逆境與發(fā)育兩種生命活動。

2.2 基因結(jié)構(gòu)分析及染色體定位

葡萄71個NAC基因在染色體上數(shù)量分布不均勻，其中第5、第9號染色體未找到NAC基因。位于第19號染色體上的NAC基因數(shù)量最多（19個）。非生物脅迫相關(guān)NAC基因散亂分布在1、4、6、7、8、12、18、19共8條染色體上，未表現(xiàn)出集中性，VvNAC3基因未能定位到染色體上。葡萄的NAC基因N端都具有NAC保守結(jié)構(gòu)域。

2.3 一級結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)分析

磷酸化位點(diǎn)分析顯示，葡萄非生物逆境脅迫相關(guān)NAC蛋白中絲氨酸磷酸化位點(diǎn)最多，酪氨酸磷酸化位點(diǎn)次之。通過ProtParam程序進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果顯示非逆境脅迫相關(guān)NAC蛋白既有酸性氨基酸，又有堿性氨基酸。從蛋白質(zhì)穩(wěn)定性上看，VvNAC26，VvNAC 42，VvNAC45為穩(wěn)定蛋白，其余均為不穩(wěn)定蛋白（表1）。

2.4 二級結(jié)構(gòu)分析及亞細(xì)胞定位

在線二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，非生物逆境脅迫NAC蛋白中隨機(jī)卷曲的比例很高（58.59%～70.35%），它起著鏈接其他二級結(jié)構(gòu)原件的作用。此外，主要的二級結(jié)構(gòu)原件為α螺旋（14.07%～30.81%）和延伸鏈（9.89%～20.83%），主要位于α螺旋和隨機(jī)卷曲之間。在線WOLF PSORT對蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示，非生物脅迫相關(guān)NAC蛋白全部定位于細(xì)胞核。

3 結(jié)論與討論

對葡萄71種NAC蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建，染色體定位、理化性質(zhì)分析，二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及亞細(xì)胞定位等方面的分析。系統(tǒng)發(fā)生樹顯示，所有的非生物逆境脅迫相關(guān)NAC蛋白都聚為一類，這與其他NAC類蛋白的研究結(jié)果相符合[10-11]，也暗示在NAC家族成員中，脅迫相應(yīng)NAC類轉(zhuǎn)錄因子之間具有密切聯(lián)系。非生物脅迫相關(guān)NAC蛋白全部定位于細(xì)胞核。由此推斷，具有相近生物學(xué)功能的NAC蛋白更可能定位于相同的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，這與其發(fā)揮特定生物學(xué)功能密切相關(guān)。非生物逆境脅迫類NAC蛋白既有其共同點(diǎn)也有不同點(diǎn)，這些分析與研究結(jié)果，有助于對葡萄NAC基因調(diào)控葡萄的生長與抗逆機(jī)制開展進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

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2.4 二級結(jié)構(gòu)分析及亞細(xì)胞定位

在線二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，非生物逆境脅迫NAC蛋白中隨機(jī)卷曲的比例很高（58.59%～70.35%），它起著鏈接其他二級結(jié)構(gòu)原件的作用。此外，主要的二級結(jié)構(gòu)原件為α螺旋（14.07%～30.81%）和延伸鏈（9.89%～20.83%），主要位于α螺旋和隨機(jī)卷曲之間。在線WOLF PSORT對蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示，非生物脅迫相關(guān)NAC蛋白全部定位于細(xì)胞核。

3 結(jié)論與討論

對葡萄71種NAC蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建，染色體定位、理化性質(zhì)分析，二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及亞細(xì)胞定位等方面的分析。系統(tǒng)發(fā)生樹顯示，所有的非生物逆境脅迫相關(guān)NAC蛋白都聚為一類，這與其他NAC類蛋白的研究結(jié)果相符合[10-11]，也暗示在NAC家族成員中，脅迫相應(yīng)NAC類轉(zhuǎn)錄因子之間具有密切聯(lián)系。非生物脅迫相關(guān)NAC蛋白全部定位于細(xì)胞核。由此推斷，具有相近生物學(xué)功能的NAC蛋白更可能定位于相同的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，這與其發(fā)揮特定生物學(xué)功能密切相關(guān)。非生物逆境脅迫類NAC蛋白既有其共同點(diǎn)也有不同點(diǎn)，這些分析與研究結(jié)果，有助于對葡萄NAC基因調(diào)控葡萄的生長與抗逆機(jī)制開展進(jìn)一步研究。

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2.4 二級結(jié)構(gòu)分析及亞細(xì)胞定位

在線二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，非生物逆境脅迫NAC蛋白中隨機(jī)卷曲的比例很高（58.59%～70.35%），它起著鏈接其他二級結(jié)構(gòu)原件的作用。此外，主要的二級結(jié)構(gòu)原件為α螺旋（14.07%～30.81%）和延伸鏈（9.89%～20.83%），主要位于α螺旋和隨機(jī)卷曲之間。在線WOLF PSORT對蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示，非生物脅迫相關(guān)NAC蛋白全部定位于細(xì)胞核。

3 結(jié)論與討論

對葡萄71種NAC蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建，染色體定位、理化性質(zhì)分析，二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及亞細(xì)胞定位等方面的分析。系統(tǒng)發(fā)生樹顯示，所有的非生物逆境脅迫相關(guān)NAC蛋白都聚為一類，這與其他NAC類蛋白的研究結(jié)果相符合[10-11]，也暗示在NAC家族成員中，脅迫相應(yīng)NAC類轉(zhuǎn)錄因子之間具有密切聯(lián)系。非生物脅迫相關(guān)NAC蛋白全部定位于細(xì)胞核。由此推斷，具有相近生物學(xué)功能的NAC蛋白更可能定位于相同的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，這與其發(fā)揮特定生物學(xué)功能密切相關(guān)。非生物逆境脅迫類NAC蛋白既有其共同點(diǎn)也有不同點(diǎn)，這些分析與研究結(jié)果，有助于對葡萄NAC基因調(diào)控葡萄的生長與抗逆機(jī)制開展進(jìn)一步研究。

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