王永娟，張 杰，孔繁芳，南宮自艷，宋 萍，王勤英

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河北保定 071000)

嗜線蟲致病桿菌Xenorhabdus nematophila 與小卷蛾斯氏線蟲Steinerne macarpocapsae 呈互惠共生關(guān)系，線蟲-共生菌復(fù)合體共同侵染昆蟲，短時(shí)間內(nèi)造成昆蟲患敗血病死亡，在防治多種地下害蟲中起重要作用。研究表明，嗜線蟲致病桿菌可以分泌多種殺蟲物質(zhì)，在線蟲-共生菌復(fù)合體中起殺死昆蟲的作用(Park et al.，2000;Owuama，2001)。近年來(lái)，隨著研究不斷深入，除殺蟲活性外，嗜線蟲致病桿菌其他功能也被不斷發(fā)現(xiàn)，可以合成各種抗菌物質(zhì)，對(duì)多種植物病原微生物具有抑制作用(劉霞等，2006;馬麗麗等，2007);與蘇云金芽孢桿菌(Sungchae et al.，2006)、化學(xué)殺蟲劑(李立濤等，2011)混合使用可以提高殺蟲效果。嗜線蟲致病桿菌具有殺蟲譜廣、殺蟲活性高、抑菌作用強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的開發(fā)利用前景，世界各國(guó)對(duì)共生菌資源亦日趨重視。

近年來(lái)有關(guān)嗜線蟲致病桿菌發(fā)酵的研究也成為了熱點(diǎn)，但是相關(guān)研究?jī)?nèi)容主要集中在抗生素的產(chǎn)生和抑菌活性上(李騫等，2006)，而關(guān)于影響嗜線蟲致病桿菌殺蟲活性的發(fā)酵因子卻很少報(bào)道。嗜線蟲致病桿菌Xn HB310 是本實(shí)驗(yàn)室分離得到的一株具有高殺蟲活性的菌株，前期工作對(duì)它的殺蟲活性和殺蟲機(jī)理進(jìn)行了深入研究(王勤英等，2005;Wang et al.，2012)。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)Xn HB310 菌株殺蟲活性，利用正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，明確其最佳發(fā)酵條件，提高發(fā)酵效率，為以后規(guī)?；⑸唐坊a(chǎn)微生物殺蟲劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株:嗜線蟲治病桿菌HB310 菌株(Xn HB310)保存于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)害蟲生物防治實(shí)驗(yàn)室，從小卷蛾斯氏線蟲體內(nèi)分離獲得，以NBTA 為鑒別培養(yǎng)基確定菌株的初生型。

供試蟲源:小菜蛾P(guān)lutella xylostella 由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)害蟲生物防治實(shí)驗(yàn)室提供，置于25±1℃，RH 65%-75%、光照16 h 的人工氣候箱內(nèi)，用蘿卜苗飼養(yǎng)至2 齡幼蟲，挑選健康整齊幼蟲供試。

培養(yǎng)基:NBTA 鑒別培養(yǎng)基(營(yíng)養(yǎng)瓊脂45 g，氯化三苯基四氮唑0.04 g，溴百里酚藍(lán)0.025 g)、BR 培養(yǎng)基(牛肉蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g)、NA 培養(yǎng)基(牛肉膏5 g，牛肉蛋白胨6 g，NaCl 5 g)、KB 培養(yǎng)基(牛肉蛋白胨5 g，酵母浸粉3 g，葡萄糖2.5 g)、BM 培養(yǎng)基((NH4)2SO41 g，K2HPO47 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，葡萄糖1 g，牛肉蛋白胨1 g，酵母浸粉5 g)、BPY培養(yǎng)基(牛肉蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化鈉5 g，酵母浸粉5 g，葡萄糖5 g)和YS 培養(yǎng)基((NH4)2SO40.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 5 g，酵母提取物5 g)。以上培養(yǎng)基皆定容1000 mL，pH 值7.0-7.2。

1.2 生物測(cè)定方法

采用浸葉法對(duì)小菜蛾進(jìn)行生物測(cè)定(李立濤等，2011)，取甘藍(lán)葉片在加有0.3% 吐溫-80 的菌液中浸泡10 s，取出后自然晾干，放入滅菌養(yǎng)蟲盒中，接入小菜蛾2 齡幼蟲，每盒15 頭，每個(gè)處理設(shè)3 次重復(fù)，以含有0.3% 吐溫-80 的無(wú)菌水處理作為對(duì)照，25℃培養(yǎng)72 h 后，統(tǒng)計(jì)死亡數(shù)并計(jì)算死亡率。對(duì)生測(cè)數(shù)據(jù)均通過(guò)DPS 軟件分析，采用Dunan's 新復(fù)極差法統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均為平均數(shù)±SE (mean±SE)。

1.3 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選

從NBTA 培養(yǎng)基上挑取Xn HB310 初生型單菌落，接入BR 培養(yǎng)基中，28℃、200 rpm 培養(yǎng)14 h，按1% 接種量分別接入到不同培養(yǎng)基，28℃、200 rpm培養(yǎng)，每隔2 h 取一次菌液測(cè)定OD600，培養(yǎng)48 h 后，測(cè)定其殺蟲活性，方法見1.2。

1.4 最佳碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽的選擇與優(yōu)化

采用單因素方法確定最佳三大營(yíng)養(yǎng)源。分別在BR 培養(yǎng)基中加入1%的蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖和麥芽糖為不同碳源;以1.5%的牛肉蛋白胨、蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸膏、干酪素和尿素作為不同氮源;以0.5% 的 MgSO4、MgCl2、KCl、(NH4)2SO4、KH2PO4和NaH2PO4為無(wú)機(jī)鹽，其他組分相同，28℃、200 rpm 培養(yǎng)48 h 后檢測(cè)菌株OD600，測(cè)定其殺蟲活性，方法見1.2。

在確定最佳碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽的基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化三大營(yíng)養(yǎng)源的用量，因素水平見表1，其中A 因素為葡萄糖、B 因素為牛肉蛋白胨、C 因素為牛肉浸膏和D 因素為KH2PO4。

表1 培養(yǎng)基優(yōu)化設(shè)計(jì)表Table 1 Optimization design of medium

1.5 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)接種量、培養(yǎng)時(shí)間、溫度、培養(yǎng)基初始pH 值、搖床轉(zhuǎn)速和裝液量等6 個(gè)因素對(duì)菌株生長(zhǎng)及殺蟲活性的影響進(jìn)行了研究，并確定了最佳的培養(yǎng)方案。原始發(fā)酵條件為:將種子菌以1%接種接入到置于500 mL 搖瓶?jī)?nèi)的100 mL BR培養(yǎng)基中，200 rpm、28℃培養(yǎng)48 h。測(cè)定菌液OD600和殺蟲活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)Xn HB310 菌株生長(zhǎng)和殺蟲活性的影響

將Xn HB310 菌株分別接入6種不同培養(yǎng)基，在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定菌液OD600，繪制生長(zhǎng)曲線，最后測(cè)定各菌液的殺蟲活性，結(jié)果見圖1 和圖2。從圖1 可以看出，Xn HB310 菌株在BR 培養(yǎng)基中OD600最高，生長(zhǎng)情況最好;圖2 也顯示BR 培養(yǎng)基中的Xn HB310 菌株殺蟲活性高于其他培養(yǎng)基，且差異顯著(P≤0.05，下同)。因此選擇BR 培養(yǎng)基作為后繼研究的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

圖1 嗜線蟲致病桿菌HB310 在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Xenorhabdus nematophila HB310 in the different culture medium

圖2 嗜線蟲致病桿菌HB310 在不同培養(yǎng)基中對(duì)小菜蛾幼蟲的殺蟲活性Fig.2 Insectical activity of X.nematophila HB310 in the different culture medium against the larvae P.xylostella

2.2 碳源對(duì)Xn HB310 菌株生長(zhǎng)及殺蟲活性的影響

由表2 可以看出，當(dāng)以葡萄糖、蔗糖和麥芽糖作為碳源時(shí)，Xn HB310 菌株的殺蟲活性高于以果糖和麥芽糖為碳源時(shí)的活性，而且前三者沒有顯著差異;但是以葡萄糖為碳源時(shí)，菌液OD600顯著高于其它碳源。綜合以上兩個(gè)因素考慮，選擇葡萄糖為最佳碳源。

表2 不同碳源對(duì)嗜線蟲致病桿菌Xn HB310生長(zhǎng)及殺蟲活性的影響Table 2 Effect of different carbon sources on the growth and insecticidal activity of Xn HB310

2.3 氮源對(duì)Xn HB310 菌株生長(zhǎng)和殺蟲活性的影響

不同氮源對(duì)Xn HB310 菌株的影響見表3，由表3 可以看出，以牛肉浸膏和牛肉蛋白胨為氮源時(shí)，培養(yǎng)的Xn HB310 菌液的殺蟲活性顯著高于其它氮源。雖然以牛肉浸膏和牛肉蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌液OD600值差異顯著，但是兩種菌液對(duì)小菜蛾致死率都很高，且差異不顯著，所以選擇牛肉浸膏和牛肉蛋白胨共為最佳氮源。

2.4 無(wú)機(jī)鹽對(duì)Xn HB310 菌株生長(zhǎng)和殺蟲活性的影響

測(cè)定不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)Xn HB310 菌株影響，結(jié)果顯示(表4)，當(dāng)以KH2PO4和NaH2PO4作為無(wú)機(jī)鹽時(shí)，Xn HB310 菌株的殺蟲活性高于其它無(wú)機(jī)鹽，并且無(wú)顯著差異，但是菌液在KH2PO4條件下生長(zhǎng)情況優(yōu)于后者，所以選擇KH2PO4作為最適無(wú)機(jī)鹽。

表3 不同氮源對(duì)嗜線蟲致病桿菌HB310 生長(zhǎng)及殺蟲活性的影響Table 3 Effect of different nitrogen sources on the growth and insecticidal activity of X.nematophila HB310

表4 無(wú)機(jī)鹽對(duì)嗜線蟲致病桿菌HB310 生長(zhǎng)及殺蟲活性的影響Table 4 Effect of inorganic salt on the growth and insecticidal activity of Xn HB310

2.5 培養(yǎng)基的優(yōu)化

在確定最適碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽的基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)Xn HB310 發(fā)酵培養(yǎng)基成分的用量進(jìn)行了優(yōu)化。表5 結(jié)果表明，葡萄糖的用量對(duì)Xn HB310 菌株產(chǎn)殺蟲活性物質(zhì)的影響最大，增加葡萄糖用量可顯著提高菌株的殺蟲活性，其次是牛肉蛋白胨，葡萄糖與牛肉蛋白胨的交互作用可忽略不計(jì)，而葡萄糖與牛肉浸膏的交互作用對(duì)產(chǎn)殺蟲活性物質(zhì)有一定的影響。從均值1 和均值2 可以看出，培養(yǎng)基的優(yōu)化組合為葡萄糖2%，牛肉蛋白胨1%，牛肉浸膏0.3%和K2HPO41%。將其培養(yǎng)的Xn HB310 菌液稀釋10 倍對(duì)小菜蛾二齡幼蟲的致死率為92%，而以稀釋10 倍BR 培養(yǎng)基培養(yǎng)的Xn HB310 菌液，對(duì)小菜蛾二齡幼蟲的致死率為60.7%。

表5 培養(yǎng)基的優(yōu)化Table 5 Optimization of medium

2.6 接種量對(duì)Xn HB310 菌株生長(zhǎng)和殺蟲活性的影響

接種量對(duì)Xn HB310 的影響結(jié)果表明(見表6)，當(dāng)接種量在3%-6%時(shí)，小菜蛾幼蟲的死亡率無(wú)顯著差異，皆高于其他接種量，但是，當(dāng)接種量為6%時(shí)，菌液OD600顯著高于其他接種量，因此選擇6%的接種量進(jìn)行接種。

表6 接種量對(duì)嗜線蟲致病桿菌HB310 生長(zhǎng)及殺蟲活性的影響Table 6 Effect of inoculum size on the growth and insecticidal activity of Xn HB310

(續(xù)上表)

2.7 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)Xn HB310 菌株生長(zhǎng)和殺蟲活性的的影響

分別取培養(yǎng)不同時(shí)間的Xn HB310 菌液，檢測(cè)其生長(zhǎng)情況并測(cè)定殺蟲活性，結(jié)果見表7。由表7可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，Xn HB310 菌株的OD600隨之升高，殺蟲活性也同步提高，到達(dá)48 h時(shí)，兩項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到最高值，顯著高于其他培養(yǎng)時(shí)間，之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株的生長(zhǎng)情況和殺蟲活性呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明菌液由穩(wěn)定期發(fā)展為衰亡期，菌液殺蟲活性也隨之下降。綜上所述，選擇48 h 作為發(fā)酵時(shí)間。

表7 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)嗜線蟲致病桿菌HB310 生長(zhǎng)及殺蟲活性的影響Table 7 Effect of culturing time on the growth and insecticidal activity of Xn HB310

2.8 培養(yǎng)溫度對(duì)Xn HB310 菌株生長(zhǎng)和殺蟲活性的影響

不同溫度對(duì)菌株發(fā)酵影響結(jié)果見表8。由表8可以看出，不同溫度對(duì)菌株的發(fā)酵影響較大，溫度過(guò)高或過(guò)低，菌株生長(zhǎng)緩慢甚至停止生長(zhǎng)，失去殺蟲活性;當(dāng)溫度為28℃時(shí)，Xn HB310 的OD600和殺蟲活性最高，且差異性顯著，因此選擇28℃為菌株Xn HB310 最適發(fā)酵溫度。

2.9 培養(yǎng)基初始pH 值對(duì)Xn HB310 菌株生長(zhǎng)和殺蟲活性的影響

培養(yǎng)基不同pH 值對(duì)菌株Xn HB310 生長(zhǎng)影響見表9。結(jié)果表明，pH 值在6.0-7.5 范圍之間，菌株Xn HB310 的OD600及殺蟲活性隨pH 值升高而升高;當(dāng)pH 值達(dá)到7.5 時(shí)，菌液生長(zhǎng)和殺蟲活性都顯著高于其他pH 值;當(dāng)高于8.0 時(shí)，菌株生長(zhǎng)和殺蟲活性就受到抑制。因以選用pH 值7.5 為發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH 值。

表9 初始pH 值對(duì)嗜線蟲致病桿菌HB310 生長(zhǎng)及殺蟲活性的影響Table 9 Effect of initial pH value on the growth and insecticidal activity of Xn HB310

2.10 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)Xn HB310 菌株生長(zhǎng)和殺蟲活性的影響

設(shè)定不同轉(zhuǎn)速對(duì)Xn HB310 菌株進(jìn)行發(fā)酵，48 h 時(shí)檢測(cè)菌液的OD600值和殺蟲活性。結(jié)果如表10 所示，隨著轉(zhuǎn)速的升高，OD600值隨之增加，菌株生長(zhǎng)速度加快，殺蟲活性也逐漸升高;轉(zhuǎn)速為200 rpm 時(shí)，Xn HB310 的OD600和殺蟲活性達(dá)到最高，且差異性顯著;當(dāng)達(dá)到250 rpm 時(shí)，OD600值和殺蟲活性都有所降低，所以選用轉(zhuǎn)速為200 rpm。

表10 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)Xn HB310 生長(zhǎng)及殺蟲活性的影響Table10 Effect of shaking speed on the growth and insecticidal activity of Xn HB310

2.11 裝液量對(duì)Xn HB310 菌株生長(zhǎng)和殺蟲活性的影響

在500 mL 搖瓶中分別加入不同體積培養(yǎng)基，對(duì)Xn HB310 進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果表明，當(dāng)裝液量在50-150 mL 之間時(shí)，殺蟲活性較高且差異不顯著，當(dāng)裝液量為100 mL 時(shí)，菌株OD600值顯著高于其他裝液量，說(shuō)明該裝液量最適合菌株生長(zhǎng)，因此選擇100 mL/500 mL 三角瓶裝液量來(lái)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

表11 裝液量對(duì)嗜線蟲致病桿菌HB310 生長(zhǎng)及殺蟲活性的影響Table 11 Effect of loading amount on the growth and insecticidal activity of Xn HB310

3 結(jié)論與討論

小菜蛾的危害具有隱蔽性且世代重疊嚴(yán)重，防治十分困難，因此小菜蛾已經(jīng)成為世界性害蟲。在田間，小菜蛾對(duì)多種化學(xué)農(nóng)藥及生物農(nóng)藥Bt(Liu et al.，1998;楊峰山等，2006)已經(jīng)表現(xiàn)出了很強(qiáng)抗性，所以開發(fā)和推廣新的殺蟲資源至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，嗜線蟲致病桿菌Xn HB310 對(duì)小菜蛾具有很強(qiáng)的殺蟲效果(王勤英等，2004)。楊云艷等(2012)針對(duì)嗜線蟲致病桿菌對(duì)小菜蛾的致死和亞致死效應(yīng)進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)Xn HB310 不僅對(duì)小菜蛾幼蟲有很強(qiáng)的殺蟲活性，而且與Bt 無(wú)交互抗性。Wang 等(2012)對(duì)Xn HB310 菌株的殺蟲機(jī)理進(jìn)行了研究，他們從菌體細(xì)胞中分離出了一種復(fù)合蛋白Xnpt，通過(guò)組織病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，Xnpt 可以破壞中腸組織和抑制中腸蛋白酶活性，對(duì)小菜蛾具有拒食作用和致死作用。此外，近期研究表明，來(lái)自昆蟲病原線蟲共生菌的這類復(fù)合殺蟲蛋白毒素的殺蟲機(jī)理不同于Bt Cry 毒素(Meusch，et al.，2014)，因此嗜線蟲致病桿菌作為治理Bt 抗性小菜蛾種群的一種新的生防武器，具有潛在的開發(fā)利用價(jià)值。

本研究以Xn HB310 菌液OD600值和殺蟲活性為指標(biāo)，采用單因素方法和正交試驗(yàn)來(lái)優(yōu)化菌株Xn HB310 的發(fā)酵條件，最終得到最優(yōu)培養(yǎng)基和最佳發(fā)酵條件。優(yōu)化后的菌液殺蟲活性比對(duì)照提高了31.3%。本研究中，溫度和培養(yǎng)基pH 值是影響菌株生長(zhǎng)的最主要因素，當(dāng)溫度和pH 值過(guò)高或過(guò)低時(shí)，菌株無(wú)法正常生長(zhǎng)，殺蟲活性也急劇下降，甚至失去殺蟲活性。這可能是由于溫度和pH 值不但影響菌株的代謝速度，而且可能會(huì)造成代謝走向發(fā)生不可逆的改變。其他因素對(duì)菌株的生長(zhǎng)代謝有一定影響，影響效果雖不及以上兩個(gè)因素，但是如果作為微生物殺蟲劑進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，其它因素也不可忽略。

楊秀芬等 (2006)曾針對(duì)致病桿菌 D43(Xenorhabdus sp.D43)的抑菌活性對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行了研究，確定該菌株的最佳三大營(yíng)養(yǎng)源為麥芽糖、牛肉蛋白胨和CaCl2。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論不同，可能是由于嗜線蟲致病桿菌產(chǎn)生殺蟲蛋白所需營(yíng)養(yǎng)不同于產(chǎn)生抑菌物質(zhì)所需營(yíng)養(yǎng)。但是，楊秀芬等(2006)所提出的接種量、裝液量和培養(yǎng)基初始pH 值的結(jié)論與本實(shí)驗(yàn)一致，說(shuō)明嗜線蟲致病桿菌殺蟲和抑菌的最適條件是相似的。因此，針對(duì)不同目的摸索相應(yīng)的發(fā)酵條件以達(dá)到最好的效果是必須的。

發(fā)酵優(yōu)化是生防微生物產(chǎn)業(yè)化的前期基礎(chǔ)，本研究初步探索了實(shí)驗(yàn)室條件下不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和發(fā)酵條件對(duì)Xn HB310 菌株殺蟲活性的影響，為進(jìn)行下一步發(fā)酵罐發(fā)酵提供了理論基礎(chǔ)。但是作為產(chǎn)品進(jìn)行商品化推廣還會(huì)受到發(fā)酵技術(shù)和生產(chǎn)成本等因素的影響，需要開發(fā)更加廉價(jià)高效的發(fā)酵方法，這就有待于進(jìn)一步的試驗(yàn)探索。

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