黃 燕 譚建寧 馬雯芳

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530001）

龍脷葉為大戟科植物龍脷葉Sauropus spatuli folius Beille的干燥葉，主要分布在廣西、廣東、福建等地，《廣西本草選編》（第一版）和《廣西藥用植物名錄》均有收載[1-2]。龍脷葉既可食用又可入藥：壯藥記載龍脷葉能通氣道、谷道，潤肺止咳，滑腸通便，因潤肺止咳的功效而用于治療埃?。人裕貝?，阿意囊（便秘），是臨床上常用壯藥[3]。2010 版《中國藥典》將龍利葉收載其中，其性甘、淡、平; 歸肺、胃經(jīng)；具有潤肺止咳，通便等功效; 主要用于肺燥咳嗽，咽痛失音，便秘等[4]。華南地區(qū)民間常用它煲涼茶以祛痰化濕，也可與瘦豬肉或豬肺同煮，治療肺熱咳嗽、失音、喉痛、急性支氣管炎、上呼吸道炎等癥。有文獻報道[5]，龍利葉的提取液對金黃色葡萄球菌、血液性鏈球菌有明顯的抑制作用，但是對龍脷葉抑菌活性成分的研究工作還不夠系統(tǒng)和深入。本研究通過考察龍脷葉醇提取物對六種常見呼吸道、腸道致病菌的體外抑菌作用，篩選出龍脷葉的抗菌活性部位，為進一步分離活性成分及其綜合開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

（1）材料。龍脷葉2013年4月購于玉林藥材批發(fā)市場，經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院嚴(yán)克儉助理研究員鑒定，為大戟科植物龍脷葉Sauropus spatuli folius Beille的干燥葉。粉碎成粗粉（過20目篩），待用。

（2）供試菌株。金黃色葡萄球菌（ATCC 26003）、大腸桿菌（ATCC 44102）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、傷寒沙門氏菌（ATCC 50075）均購自中國食品藥品檢定研究院；金黃色葡萄球菌耐藥株、乙型副傷寒沙門氏菌由廣西中醫(yī)藥大學(xué)微生物教研室保存并提供。

（3）儀器與試劑。無菌凈化工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海醫(yī)療器械七廠）；壓力蒸汽滅菌器（上海醫(yī)用核子儀器廠）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進醫(yī)療器械廠），KQ5200B型超聲提取儀，RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），恒溫水浴鍋（DK-98-∏A）。營養(yǎng)瓊脂（BR），石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二甲基亞砜（DMSO）均為分析純，水為蒸餾水。

1.2 試驗方法

（1）龍脷葉提取物的制備。取龍脷葉粗粉 50g，分別用10 倍量的50%乙醇、70%乙醇和95%乙醇80℃回流提取兩次，每次2 h，濾過，合并濾液得到龍脷葉不同濃度乙醇的提取液。將以上龍脷葉醇提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)并揮干溶劑，得到乙醇浸膏。用20%的二甲基亞砜分別溶解后得到龍脷葉50%乙醇提取物、70%乙醇提取物和95%乙醇提取物，濃度分別為0.5 g·mL-1（按每毫升所含的生藥計），滅菌后放冰箱保存?zhèn)溆谩Ａ砣↓埫毴~粗粉50g，加入500ml 蒸餾水，超聲提取1小時，濃縮得到浸膏。用20%的二甲基亞砜溶解，得到龍脷葉水提取物，濃度為0.5 g·mL-1（按每毫升所含的生藥計），滅菌，備用。

（2）龍脷葉50%乙醇提取物不同萃取部位的制備。取龍脷葉粗粉50g，加10 倍量的50%乙醇于80℃回流提取2h，濾過。50%乙醇提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)并揮干溶劑，得到浸膏。浸膏以水分散均勻，用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次進行萃取分離。將各萃取層真空濃縮至干，用20%的二甲基亞砜分別溶解后得到得石油醚萃取相、乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相。濃度分別為0.5 g·mL-1（按每毫升所含的生藥計），滅菌后放冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）MH培養(yǎng)基的制備。稱取營養(yǎng)瓊脂76g，加蒸餾水1000mL，按常規(guī)方法配制，于高壓蒸汽滅菌（0.15 MPa，125℃，30 min）后置于50℃水浴平衡，備用。

（4）供試菌的活化及菌懸液的制備。首先把金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌耐藥株、乙型副傷寒沙門氏菌在MH培養(yǎng)基的斜面上傳3次，使其生長穩(wěn)定，狀態(tài)良好。在制好的平板上劃定區(qū)域后用2μL定量接種環(huán)進行細菌接種。將供試菌株分別接種于MH平板上，待接種點菌液干后，置 37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，進行活化。挑取活化后的各菌種置于無菌生理鹽水管中，校正濃度至0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木?，然后稀?0倍（約含菌1.5 × 107CFU·mL-1）。稀釋后菌液應(yīng)在15 min 內(nèi)接種完畢。

1.3 最低抑菌濃度（MIC）的測定

（1）龍脷葉提取物最低抑菌濃度的測定。[6]采用連續(xù)二倍梯度瓊脂稀釋法測定最低抑菌濃度（MIC）。分別取10 mL龍脷葉水提取物、50%乙醇提取物、70%乙醇提取物和95%乙醇提取物（0.5 g·mL-1），加入10 mL滅菌蒸餾水（0.15MPa，125 ℃，30 min滅菌），在MH培養(yǎng)基中充分混勻，制備厚度為4mm，內(nèi)徑為90mm的含藥平板，每塊含藥平板含有龍脷葉提取物的濃度分別為250、125、62.5、31.3、15.6、7.81、3.91、1.95、0.976、0.488 mg·mL-1（按每毫升所含的生藥計）等10個濃度，冷卻凝固，在含藥平板上劃定區(qū)域，每個平皿中加入菌懸液0.1 mL，用涂布棒涂布均勻，平板置 37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后后觀察結(jié)果，以無細菌生長的提取物最低濃度為最低抑菌濃度。同時設(shè)20%的二甲基亞砜為空白對照。各濃度含藥平板平行制備三份。

（2）龍脷葉50%乙醇提取物不同萃取部位最低抑菌濃度的測定。采用連續(xù)二倍梯度瓊脂稀釋法測定最低抑菌濃度（MIC）。取15 mL龍脷葉50%乙醇提取物（0.5 g·mL-1），加入15 mL滅菌蒸餾水（0.15MPa，125 ℃，30 min滅菌），在MH培養(yǎng)基中充分混勻，制備厚度為4mm，內(nèi)徑為90mm的含藥平板，每塊含藥平板含有龍脷葉提取物的濃度分別為250、125、62.5、31.3、15.6、7.81、3.91、1.95、0.976、0.488 mg·mL-1（按每毫升所含的生藥計）等10個濃度，冷卻凝固，在含藥平板上劃定區(qū)域，每個平皿中加入菌懸液0.1 mL，用涂布棒涂布均勻,平板置 37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后后觀察結(jié)果，以無細菌生長的提取物最低濃度為最低抑菌濃度。同時設(shè)鹽酸環(huán)丙沙星（5mg·mL-1）的平板為陽性對照，20%的二甲基亞砜為空白對照。各濃度含藥平板平行制備三份。

2 結(jié)果與分析

2.1 龍脷葉提取物最低抑菌濃度（MIC）試驗結(jié)果

將六種供試菌株，按每系列濃度平行測定三次，重復(fù)觀察，所得結(jié)果見表 1。從表 1 可知，龍脷葉水提取物和50%乙醇提取物對六種供試菌株均有較好的抑菌作用，兩者比較，以50%乙醇提取物抑菌效果最好，其最小抑菌濃度在31.3～62.5 mg·mL-1之間；龍脷葉50%乙醇提取物對六種供試菌株均有較好的抑菌作用，其最小抑菌濃度在31.3～62.5 mg·mL-1之間；龍脷葉70%乙醇提取物僅對金黃色葡萄球菌有明顯抑菌作用，其最小抑菌濃度在62.5～125mg·mL-1之間；龍脷葉95%乙醇提取物對六種供試菌株的抑菌作用均不明顯，其最小抑菌濃度在125～250mg·mL-1之間。由此結(jié)果，我們選擇抑菌作用較強的50%乙醇提取物做進一步的分部位萃取，測定龍脷葉不同溶劑提取物的最低抑菌濃度（MIC），觀察其不同溶劑提取物的抑菌效果。

表1 龍脷葉不同溶劑提取物最低抑菌濃度（MIC）測定結(jié)果（n=3）

2.2 龍脷葉50%乙醇提取物不同萃取部位最低抑菌濃度（MIC）試驗結(jié)果

對龍脷葉 50%乙醇提物三個萃取部位分別進行最低抑菌濃度（MIC）的測定，結(jié)果見表2。從表 2 可知，龍脷葉醇提物石油醚部位對傷寒沙門氏菌的抑菌作用最強，對六種供試菌株的 MIC分別為：對金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌耐藥株和銅綠假單胞菌的MIC為250mg·mL-1，對大腸桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌的MIC為125 mg·mL-1，對傷寒沙門氏菌的MIC為62.5 mg·mL-1；龍脷葉醇提物乙酸乙酯部位對六種供試菌株的抑菌作用均不明顯，其 MIC分別為：對金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌耐藥株和乙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌的MIC為250mg·mL-1，對大腸桿菌、銅綠假單胞菌的MIC為125 mg·mL-1；龍脷葉醇提物正丁醇部位對六種供試菌株均有明顯的抑菌作用，其 MIC分別為：對金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌耐藥株、大腸桿菌的MIC為15.6 mg·mL-1，對銅綠假單胞菌、乙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌的MIC為7.81 mg·mL-1。

表2 龍脷葉50%乙醇提取物不同萃取部位最低抑菌濃度（MIC）測定結(jié)果（n=3）

3 討論與結(jié)論

（1）龍脷葉（Sauropus spatuli folius Beille）常用于治療上呼吸道炎癥引起的咳嗽，咽痛、急性支氣管炎等癥，故本試驗選擇常見的六種呼吸道、腸道致病菌，即革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、金黃色葡萄球菌耐藥株（Methicillin resistant Staphylococcus aureus）和革蘭氏陰性菌：大腸桿菌（Escherichia coli）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、傷寒沙門氏菌（Salmonella typhi）和乙型副傷寒沙門氏菌（Bacillus paratyphosus B）進行體外抑菌作用，結(jié)果表明龍脷葉乙醇提取物具有一定的體外抑菌作用。

（2）環(huán)丙沙星為合成的第二代喹諾酮類抗菌藥物,具廣譜抗菌活性，殺菌效果好，試驗采用鹽酸環(huán)丙沙星作為陽性對照考察抑菌效果，結(jié)果龍脷葉醇提物正丁醇部位對六種試驗菌株的MIC在7.81～15.6 mg·mL-1之間，陽性對照鹽酸環(huán)丙沙星對六種試驗菌株的MIC均為 1.95 mg·mL-1，MIC相差4-8倍，表明龍脷葉醇提物正丁醇部位的抑菌效果明顯。

（3）本試驗采用連續(xù)二倍梯度瓊脂稀釋法測定 MIC，并以MIC的測定結(jié)果分別對50%、70%和95%三種濃度的乙醇提取物的抑菌作用進行跟蹤提取，再對抑菌效果明顯的50%的乙醇提取物進行分極性部位的MIC測定，確定抑菌活性部位。

（4）以 20%的二甲基亞砜作為龍脷葉提取物的溶劑，既能增加溶解度，又不會造成干擾，經(jīng)空白對照試驗對龍脷葉提取物的抑菌作用無影響。

（5）本研究對龍脷葉體外抑菌活性進行了初步研究，下一步的研究工作我們將對其進行活性指導(dǎo)下的活性化合物的進一步分離純化以及結(jié)構(gòu)解析，對單體的抗菌活性及抗菌機制進行深入的研究和探索。

[1] 廣西壯族自治區(qū)革命委員會衛(wèi)生局主編.廣西本草選編[M].第一版.南寧:廣西人民出版社,1974,1259.

[2] 廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究所編.廣西藥用植物名錄[M].廣西:廣西人民出版社,1986:198.

[3] 廣西壯族自治區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局.廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)2008年版(第一卷)[M].廣西:廣西科學(xué)技術(shù)出版社,2008: 77.

[4] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典:2010 年版一部[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社, 2010: 90.

[5] 李秉滔;草藥龍鶪葉原植物的考證[J].華南農(nóng)學(xué)院學(xué)報,1981,2(1):41.

[6] 臨床微生物學(xué)和微生物檢驗實驗指導(dǎo)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2006: 42-43.