袁葵 郭文 朱明古

1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院消化科，廣東 廣州 510515；

2.韶關(guān)市鐵路醫(yī)院消化科，廣東 韶關(guān) 512023

流行病學(xué) 調(diào)查顯示，大腸腫 瘤是世界上常見的腫 瘤之一，有較高的發(fā)病率和病 死率［1］。通過食療預(yù)防大腸腫瘤的發(fā)生和降低其對(duì)生命的威脅是目前研究的熱點(diǎn)。近來有研究發(fā)現(xiàn)，十字花科植物可以通過清除體內(nèi)自由基并誘導(dǎo)抗氧化酶形成，同時(shí)刺激免疫反應(yīng)從而達(dá)到降低腫瘤發(fā)病率的目的［2］。經(jīng)常食用辣根、甘藍(lán)、花椰菜、卷心菜等十字花科蔬菜能降低人類前列腺癌、肺癌、膀胱癌、食管癌和結(jié)腸癌等的患病危險(xiǎn)［3-4］。芥菜籽(mustard seeds，MS)是十字花科屬植物的種子，而以其干預(yù)預(yù)防腫瘤形成的研究甚少。本實(shí)驗(yàn)以1,2-二甲基肼(1,2-dimethylhydrazine，DMH)化學(xué)誘導(dǎo)的大鼠大腸腫瘤作為研究對(duì)象，研究MS對(duì)預(yù)防實(shí)驗(yàn)性大鼠大腸腫瘤作用及其作用機(jī)制，為開發(fā)利用MS預(yù)防大腸腫瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

化學(xué)誘癌劑DMH購自美國Sigma公司，以0.9%NaCl溶液配制，終質(zhì)量濃度為1 g/L，用l mol/L NaHCO3調(diào)節(jié)溶液pH值至6.5~7.0并過濾除菌；脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物 丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)及谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)測(cè)定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；LEGENDplexTMCustom Rat 3-Plex Cytokine Panel試劑盒為Biolegend公司產(chǎn)品；Luminex200為美國Millipore公司產(chǎn)品。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

48只清潔級(jí)雄性(5～6周齡)Wistar大鼠購自南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。MS購自廣州長合種子有限公司，我們根據(jù)參考文獻(xiàn)［5-6］分別設(shè)定5%和7.5%作為理想MS飼料干預(yù)濃度，在動(dòng)物中心加工制成含5%MS和7.5%MS的顆粒飼料。實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)于南方醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，顆粒飼料喂養(yǎng)，定量給食，自由取食及飲水，正常飼養(yǎng)1周，自第2周開始實(shí)驗(yàn)。飼養(yǎng)室保持良好通風(fēng)，環(huán)境溫度控制21～23 ℃，濕度控制在40%~50%，12 h循環(huán)光照。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及處理

48只Wistar大鼠隨機(jī)均分為：①DMH模型組：30 mg/kg腹腔注射DMH，每周1次，連續(xù)給藥20周，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)；②DMH+5%MS干預(yù)組：DMH給藥同模型組，5%MS顆粒飼料喂養(yǎng)；③DMH+7.5%MS干預(yù)組：DMH給藥同模型組，7.5%MS顆粒飼料喂養(yǎng)；④正常對(duì)照組：腹腔注射與DMH等量0.9%NaCl溶液，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)第32周以頸椎脫臼處死動(dòng)物取整段大腸及外周血。

1.2.2 HE染色

大腸腫瘤組織標(biāo)本在4%甲醛溶液中固定24 h，脫水，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，HE染色，中性樹膠封片。

1.2.3 血清MDA含量及抗氧化酶SOD、CAT、GSH-PX活力的檢測(cè)

采用硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA的含量；采用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)SOD的活性；采用可見光分光光度法檢測(cè)CAT的活性；采用化學(xué)比色法檢測(cè)GSH-PX的活性。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.2.4 檢測(cè)血清中的Th1亞群細(xì)胞因子和Th2亞群細(xì)胞因子的含量

設(shè)定96孔板上標(biāo)準(zhǔn)品以及待測(cè)品的位置，嚴(yán)格按照LEGENDplexTMCustom Rat 3-Plex Cytokine Panel試劑盒操作，采用Luminex200檢測(cè)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。應(yīng)用χ2檢驗(yàn)(Chi-square test)比較各組間大鼠大腸腫瘤發(fā)生率的差異，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間多重比較采用SNK方法進(jìn)行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大腸腫瘤肉眼觀察

模型組全部大鼠大腸黏膜可見向腸腔突出的大小不一的腫瘤；5%MS干預(yù)組有8只出現(xiàn)向腸腔突出的腫瘤；7.5%MS干預(yù)組有5只發(fā)現(xiàn)腸腔腫瘤(圖1)。

圖1 DMH誘導(dǎo)的大鼠大腸腫瘤的大體形態(tài) Fig.1 Morphology of DMH-induced colorectal tumors in rats

2.2 病理組織學(xué)檢查

HE染色后鏡下觀察大腸腫瘤分為腺瘤及腺癌，模型組腫瘤組織多以腺癌為主，浸潤達(dá)黏膜下層以下，而MS干預(yù)組以腺瘤為主，局限于黏膜層內(nèi)(圖2)。模型組總成瘤率為100%， 5%MS干預(yù)組和7.5%MS干預(yù)組總成瘤率分別降低33%和58.3%，正常對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)腫瘤形成。χ2檢驗(yàn)顯示，5%MS干預(yù)組和7.5%MS干預(yù)組總成瘤率與模型組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.687，P=0.008，表1)。

2.3 血清MDA含量和抗氧化 酶活力

檢測(cè)各組大鼠血清MDA的含量顯示，模型組MDA含量明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)MS干預(yù)后均呈下降趨勢(shì)，其中7.5%MS干預(yù)組下降明顯，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。檢測(cè)抗氧化酶活力顯示，各實(shí)驗(yàn)組間SOD、CAT、GSH-PX活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

圖2 DMH誘導(dǎo)大鼠大腸腫瘤過程中的黏膜病變Fig.2 Micrographs of various colorectal mucosa(HE, ×100)

表1 MS對(duì)1,2-二甲基肼誘導(dǎo)大鼠大腸腫瘤發(fā)生的影響Tab.1 Effects of mustard seeds (MS) on DMH-induced colorectal tumor in rats [n(%)]

表2 MS降低DMH誘導(dǎo)大腸腫瘤的大鼠血清MDA含量，提高SOD、CAT、GSH-PX的活力Tab.2 MS suppress lipid peroxidation and enhance the activity of serum SOD, CAT, and GSH-PX in the DMH-induced rat model (±s)

表2 MS降低DMH誘導(dǎo)大腸腫瘤的大鼠血清MDA含量，提高SOD、CAT、GSH-PX的活力Tab.2 MS suppress lipid peroxidation and enhance the activity of serum SOD, CAT, and GSH-PX in the DMH-induced rat model (±s)

*: P<0.05 vs DMH group; **: P<0.01 vs DMH group.

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2.4 Th1亞群細(xì)胞因子(IL-2、IL-l2p70、TNF-α、IFN-γ)的含量

各實(shí)驗(yàn)組中，T h 1 亞群細(xì)胞因子含量經(jīng)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PIL-2=0.022；PIL-12p70=0.037；PTNF-a=0.015；PIFN-r=0.028)，其中7.5%MS干預(yù)組IL-2［(57.50±8.76)pg/mL］含量與模型組［(48.68±6.33)pg/mL］相比顯著增加(P<0.05)；5%MS干預(yù)組IL-12p7 0、TNF-α和IFN-γ的含量分別為(22.02±5.39)pg/mL、(16.56±7.95)pg/mL 和(15.28±7.89)pg/mL，與模型組的含量［分別為(15.03±5.53) pg/mL、(10.02±1.41)pg/mL和(7.52±4.32)pg/mL］相比顯著增加(P＜0.05，圖3)。

2.5 Th2亞群細(xì)胞因子(IL-4、IL-5、IL-10、TGF-β)的含量

各實(shí)驗(yàn) 組中T h 2 亞群細(xì)胞因子含量經(jīng)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PIL-4=0.0 1 3；PIL-5=0.004；PIL-10=0.003；PTGF-β=0.039)，其中7.5%MS干預(yù)組IL-4 、IL-5含量分別為(2.4 1±0.77)pg/mL、(11.82±3.45)pg/mL，與模型組的含量［分別為(4.97±3.29)pg/mL、(26.34±12.03) pg/mL］相比顯著減少(P＜0.05)；5%MS干預(yù)組IL-10、TGF-β含量分別為(36.89±5.74)pg/mL、(1 151.23±329.28)pg/ mL，較模型組含量［分別為(49.79±9.69)pg/mL、(1 596.10±519.79)pg/mL］相比顯著減少(P<0.05，圖4)。

圖3 MS增加DMH誘導(dǎo)大腸腫瘤的大鼠Th1亞群細(xì)胞因子含量 Fig.3 MS increase levels of Th1 cytokines in the DMH-induced rat model

圖4 MS降低DMH誘導(dǎo)大腸腫瘤的大鼠Th2亞群細(xì)胞因子含量 Fig.4 MS decrease levels of Th2 cytokines in the DMH-induced rat model

3 討 論

大鼠大腸腫瘤模型的建立采用參考文獻(xiàn)的方法通過化學(xué)誘癌劑DMH成功誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生，模型組成瘤率可高達(dá)100%［7］。DMH誘導(dǎo)的大鼠大腸腫瘤符合人類大腸癌多步驟、多階段、多基因參與的慢性過程，存在息肉-腺瘤-腺癌的演變順序，為研究摹擬人類大腸癌提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。本研究結(jié)果表明，MS對(duì)DMH誘導(dǎo)的大鼠大腸腫瘤具有明顯的化學(xué)預(yù)防作用，并隨MS濃度增加總成瘤率降低顯著，其作用機(jī)制可能與其抗氧化作用和免疫平衡偏移有關(guān)。

一方面，近年來許多研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生與自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負(fù)面的氧化應(yīng)激作用有關(guān)。當(dāng)外界有毒的物理化學(xué)因素如放射線、毒物、化學(xué)致癌物等作用于機(jī)體后，自由基的產(chǎn)生與清除平衡嚴(yán)重失調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞分子結(jié)構(gòu)破壞、細(xì)胞脂質(zhì)過氧化、蛋白失去酶活性、DNA突變致癌等效應(yīng)，而天然抗氧化劑(維生素E、維生素C等)及抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-PX等)有助于對(duì)抗自由基對(duì)機(jī)體的損害［8］。因而尋找更多有效清除自由基和對(duì)抗氧化應(yīng)激破壞機(jī)體連鎖效應(yīng)的天然抗氧化劑成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，MS在干預(yù)DMH化學(xué)誘導(dǎo)大鼠形成大腸腫瘤的過程中具有極強(qiáng)的抗氧化能力，可明顯降低體內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，同時(shí)又顯著提高抗氧化酶活性。

另一方面，目前研究認(rèn)為腫瘤發(fā)生與免疫系統(tǒng)改變有密切關(guān)系，包括免疫清除、免疫平衡、免疫逃逸3個(gè)階段。當(dāng)機(jī)體免疫功能失調(diào)或低下時(shí)，發(fā)生腫瘤的概率明顯增高。機(jī)體免疫抗腫瘤的機(jī)制十分復(fù)雜，在控制具有免疫性腫瘤細(xì)胞的生長中，T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)起重要作用，其中Thl亞群細(xì)胞因子又是主導(dǎo)對(duì)抗腫瘤免疫反應(yīng)，而Th2亞群細(xì)胞因子促進(jìn)腫瘤形成［10-12］。Th1主要分泌細(xì)胞因子包含IL-2、IL-l2p70、TNF-α、IFN-γ等，而Th2主要分泌的細(xì)胞因子有IL-4、IL-5、IL-10、TGF-β等。本研究通過檢測(cè)細(xì)胞因子水平變化發(fā)現(xiàn)，MS降低大鼠大腸腫瘤的發(fā)生還體現(xiàn)在Th1/Th2免疫偏移，DMH具有誘導(dǎo)抑制殺傷腫瘤細(xì)胞的Th2免疫反應(yīng)，而MS可以使大鼠體內(nèi)免疫系統(tǒng)的Th2反應(yīng)完全逆轉(zhuǎn)為對(duì)抗腫瘤的Th1反應(yīng)，從而達(dá)到有效的預(yù)防腫瘤作用。

有文獻(xiàn)報(bào)道氧化應(yīng)激活性氧促進(jìn)TGF-β表達(dá)增多，共同介導(dǎo)腫瘤形成［13］，然而IL-4分泌增多又可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激共同促進(jìn)細(xì)胞死亡［14］。由此推斷，Th2細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激協(xié)同促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展；反之，Th1細(xì)胞因子和抗氧化作用可對(duì)抗腫瘤形成。本研究發(fā)現(xiàn)MS作為具有抗氧化作用的食品抗氧化劑同時(shí)能夠使Th1/Th2免疫平衡向Th1偏移，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。MS具有兼顧調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)和主導(dǎo)Th1免疫調(diào)節(jié)的特性，化學(xué)預(yù)防DMH誘導(dǎo)的大鼠大腸腫瘤的發(fā)生。因此，MS作為一種新的、天然的抗氧化劑和免疫調(diào)節(jié)劑，為人類大腸腫瘤的防治提供了新思路。

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