袁松濤 薛志剛 林卿 劉慶淮 范國平

年齡相關性黃斑變性（age-related macular degeneration,AMD）是引起50歲以上人群不可逆致盲眼病的首位病因[1]，全球大約有3～5千萬患者。根據(jù)脈絡膜新生血管形成或黃斑區(qū)萎縮，AMD可分為干性和濕性兩種類型。目前對于濕性AMD臨床利用Avastin、Lucentis以及光動力治療可以有效控制疾病的進展，但是在白人中濕性AMD患者僅僅占患者的10﹪～15﹪，而干性AMD患者占到85﹪～90﹪。中國人AMD的研究初步顯示中國人中干性AMD患者比例也很高[2-3]。目前臨床上沒有任何有效的治療方法可以控制干性AMD的發(fā)生發(fā)展。鑒于干性AMD病理學上表現(xiàn)為黃斑區(qū)視網膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）的變性和退化(degeneration)，因此RPE細胞移植始終被認為是治療的研究方向，移植的RPE細胞可以替代退化的細胞，相關的研究也證實RPE細胞移植可以保持或恢復患者的視力[4]。目前有多種細胞被用于實驗研究，包括人類胚胎干細胞（hESCs）或誘導性多功能干細胞（hiPSCs）分化而成的RPE細胞、自體RPE轉位移植、自體虹膜色素上皮細胞（iris pigment epithelium,IPE），以及胎兒來源RPE（fetal RPE,fRPE）。多功能干細胞來源的RPE在移植中展現(xiàn)出了非凡的前景，但是還存在潛在的形成畸胎瘤的風險和低分化率；患者自體RPE轉位移植手術復雜，存在PVR嚴重并發(fā)癥，AMD復發(fā)的問題；IPE對某些視網膜變性模型具有治療作用[5]，但是對IPE和RPE的表達譜研究表明IPE缺乏視紫紅質循環(huán)中的某些關鍵酶，并不能完全替代RPE的生理功能[6]。fRPE的移植研究也很早就有開展，具有免疫原性低、易于同宿主視網膜整合、完全的RPE功能等特點。在這里筆者描述了fRPE的原代培養(yǎng)，鑒定，以及促體外增殖的研究。本研究希望為AMD的治療提供豐富的胎兒RPE細胞來源。

材料及方法

一、fRPE細胞原代培養(yǎng)

本研究的所有工作均符合赫爾辛基宣言，并通過了倫理委員會評審。胎兒RPE細胞的培養(yǎng)基使用阿爾法基礎培養(yǎng)基（Minimum Essential Medium Eagle Alpha Modification，Sigma-Aldrich?）為基液并配以10﹪熱滅活的胎牛血清(heated inactivated FBS，Thermo Scientific No:SH30071.03IH)，2mmol/L L-谷 氨酸(L-glutamine，Gibco?),1X非必需氨基酸（1X Non essential amino acid，Gibco?），1﹪ N1補充劑（N1 supplements，Sigma-Aldrich?），0.25 mg/ml牛磺酸（Taurine，Sigma-Aldrich?），0.013 μg/L 三碘甲狀腺氨酸（Triiodo-thyronine，Sigma-Aldrich?），以 及1:100青霉素/鏈霉素(Penicillin/Streptomycin,Gibco?)和20 μg/L 氫羥腎上腺皮質素（Hydrocortisone，Sigma-Aldrich?）。

原代fRPE來源于流產胎兒眼睛，將胎兒眼睛用抗生素浸泡后，移入PBS溶液，剪除角膜，去除虹膜和晶狀體，輕輕擠出神經視網膜，可以看到眼球壁內側的一層黑色組織就是RPE。在解剖顯微鏡下，用鑷子小心撕下這一層色素膜，使其與脈絡膜分離開，剩余的半透明脈絡膜組織中有粗大的血管，揭下的RPE呈現(xiàn)小片狀單層細胞。將分離的RPE用0.25﹪胰蛋白酶（Gibco?）溶液消化處理后解離成單細胞懸液，加入培養(yǎng)基終止消化反應。將RPE懸液種植于附有基質膠的6孔培養(yǎng)板中。

二、fRPE傳代

fRPE的培養(yǎng)液每2 d需更換1次，待細胞生長至融合狀態(tài)可以傳代。將fRPE細胞培養(yǎng)基抽離后，用PBS溶液清洗細胞。將細胞浸于0.25﹪的胰蛋白酶溶液中處理15min。待細胞與組織板分離后加入培養(yǎng)基終止反應，用微量移液管反復吹打細胞結塊直至細胞結塊消失。179×g離心5min后，用培液重懸細胞。根據(jù)不同組織板的培養(yǎng)面積，將適量的細胞懸液接種于附有基質膠的培養(yǎng)板中。

三、免疫熒光染色對fRPE的鑒定

將RPE細胞分離后接種于鋪有基質膠的蓋玻片上。用1×PBS清洗后，將RPE細胞用4﹪多聚甲醛固定20～30min后，用1×PBS漂洗3次。用0.4﹪的Triton X-100對細胞通透化處理20min，用1×PBS漂洗3次。1﹪的牛血清白蛋白（BSA）封閉1h后加入一抗。本實驗中將用到anti-ZO1以及anti-RPE65作為鑒定RPE特性的抗體。溫室孵育1h后，用1×PBS漂洗3次并加入二抗避光孵育1h。用1×PBS漂洗3次后加入H33342染核5min。用PBS漂洗多余染核染料后用5μl封片劑封片。

四、二芳基脲衍生物WS3對fRPE增殖的影響

以二甲基亞砜（DMSO）溶解WS3(Xcess Biosciences,Inc)，WS3的工作濃度為25 nmol/L。將P2代fRPE細胞分3組，別培養(yǎng)在fPRE培養(yǎng)液，fRPE培養(yǎng)液添加WS3,以及加入等體積DMSO的fRPE培養(yǎng)基。培養(yǎng)基每天更換以保證RPE細胞獲得持續(xù)的WS3及DMSO的接觸。持續(xù)5 d用上文所述胰蛋白酶處理方式收集細胞，用培液重懸細胞后，將10μl細胞懸液滴入細胞計數(shù)板中計數(shù)。

五、統(tǒng)計學分析方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，對fRPE細胞增殖率采用單因素方差分析，LSD法進行兩兩比較，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、細胞培養(yǎng)和傳代

不同胎兒來源的fRPE細胞并未在原代培養(yǎng)中展現(xiàn)出不同。剛接種貼壁后第1天的fPRE可以看到明顯的色素，但是色素已經開始脫失（圖1a）。fRPE生長迅速，表現(xiàn)出極強的體外增殖能力，第3天細胞就生長到很高的密度，細胞中色素已經大部分消失，細胞呈現(xiàn)梭型（圖1b）。第10天細胞生長至碰壁狀態(tài)，進入靜止期，細胞密度不再增加。此時所有細胞展現(xiàn)出了RPE細胞鋪路石樣的典型形態(tài)，仍有部分細胞存在色素（圖1c）。如果不傳代而繼續(xù)培養(yǎng)，3周后fRPE開始合成色素顆粒，細胞內色素開始顯著增加（圖1d）。傳代后fRPE細胞則再次失去典型形態(tài)，色素完全脫失，直至細胞生長融合后3周后又再次開始合成色素。一般的fRPE可持續(xù)傳至4代左右，第3代開始的RPE較前2代生長速度明顯減緩（表1），有些細胞會展現(xiàn)出衰老的形態(tài)。

表1 初始細胞數(shù)及傳代之后10d 細胞數(shù)

二、WS3對fRPE細胞體外增殖的影響

有研究表明作為小分子化合物WS3[7]可以促進fRPE的體外增殖。本實驗探討了WS3對fRPE體外增殖的影響，三組fRPE各時間點的細胞數(shù)比較結果見表2。因三組細胞的初始接種數(shù)量不一致，因此用細胞增殖率進行統(tǒng)計檢驗，結果顯示：培養(yǎng)液中加入DMSO和WS3對fRPE增殖率的影響均有統(tǒng)計學差異（P < 0.05,n=3），各組細胞的生長曲線見（圖2）。從傳代后第4天開始，接觸WS3的fRPE表現(xiàn)輕度增強的生長趨勢，但是并未表現(xiàn)出與文獻報道中那樣明顯的促增殖作用[7]。

圖1 倒置顯微鏡明場下的fRPE細胞（×100）

三、體外培養(yǎng)的fRPE分子標志物表達的檢測

體外培養(yǎng)的fRPE通過抗體免疫熒光染色，可以檢測到各種RPE特異表達的分子標志物：ZO-1、RPE65 等（圖 3）。

討 論

fRPE的臨床研究也早有報道［8-9］，但是始終沒有得到臨床眼科的廣泛接受，除了當初研究的設備、技術條件的限制外，其中一個重要的原因就是倫理問題。胎兒組織臨床應用始終是敏感的倫理問題，包括胚胎干細胞同樣如此。本研究顯示，fRPE具有極其巨大的體外增殖能力，一只胎兒眼的RPE細胞在P0代體外就能擴增得到1千萬個RPE細胞。如果按照胚胎干細胞來源RPE臨床實驗的報道［10］，每個干性AMD患者需要移植5萬個細胞來計算，一個胎兒眼的RPE細胞能夠提供數(shù)百名AMD患者接受RPE細胞移植治療。能夠極大的減輕對fRPE臨床應用的倫理爭論，同時也徹底解決移植手術供體缺乏的問題，而且在安全性上也明顯優(yōu)于干細胞來源的RPE細胞。在fRPE培養(yǎng)的過程中也只是使用了一般的培養(yǎng)試劑，并沒有特別昂貴的細胞因子，這樣避免了患者接受移植手術需要支付高昂的治療費，這些都為fRPE的臨床應用提供了非常有利的條件。

fRPE原代培養(yǎng)中撕下RPE細胞片層是關鍵，需要精細的顯微操作。這一操作可以獲得足夠量的細胞，同時保證細胞的純度，避免其他細胞的污染。fRPE細胞原代培養(yǎng)還需要注意組織的新鮮，胎兒眼一旦離體時間過長，組織開始溶解，則不能獲得比較完整的RPE組織片層，只能零散地刮下散在的黑色素顆粒，既容易混雜有其他細胞，獲取的細胞也不易貼壁。

圖3 熒光共聚焦顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)的fRPE分子標志物形態(tài)（抗體免疫熒光染色×600））

文獻報道了WS3可以促進RPE細胞的體外增殖[7]，筆者觀察到的促增殖作用并沒有文獻報道的具有明顯促增殖作用，僅僅在融合后有輕微的促進細胞生長的趨勢，對傳代的代數(shù)影響也同樣不甚明顯。可能的原因是胎兒個體間的差異、細胞傳代時機不盡相同。此外，WS3添加的fRPE在指數(shù)生長期階段在形態(tài)上更接近于纖維細胞，和常規(guī)培養(yǎng)的RPE細胞有明顯區(qū)別。WS3的促增殖作用對fRPE的生理功能是否有影響，是否適合用于Ex Vivo治療的體外培養(yǎng)，還有待后續(xù)實驗的進一步證明。

本實驗結果顯示了fRPE巨大的體外增殖能力，在其原代體外培養(yǎng)過程中可以表達多種RPE特有的功能性標志物，為需要RPE移植的AMD患者提供了一種豐富的細胞來源。

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