王舒雨，趙明蕊，王俊巍，李云飛，岳小欣

1)河南醫(yī)學高等?？茖W校藥學系 鄭州451191 2)鄭州大學藥學院新藥研發(fā)中心 鄭州450001

蟾皮為蟾蜍科動物中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍等的皮，蟾毒噻嚀是其主要化學成分之一?，F(xiàn)代醫(yī)學研究［1］表明，蟾皮中的化學成分具有抗腫瘤、抗乙肝病毒的藥理作用。蟾皮臨床上主要用于治療乙型肝炎、慢性支氣管炎以及消除癰瘡和褪毒止痛，近年來亦用于多種癌癥的治療和輔助治療，具有縮小瘤塊、消除腹水和減緩癌癥轉移擴散速度的作用。在配合放、化療的過程中，蟾皮不僅能夠提高療效，還能減輕副作用、改善血常規(guī)［2］。作者使用超臨界CO2萃取法提取干蟾皮中的蟾毒噻嚀，觀察蟾毒噻嚀對腫瘤細胞株ECa109、HepG2、A549 生長及凋亡的影響，同時觀察其對S180 荷瘤鼠腹水瘤的抑制作用，探討蟾毒噻嚀的抗腫瘤作用。

1 材料與方法

1．1 材料 ECa109、HepG2、A549 細胞購自中國科學院上海細胞庫。干蟾皮購于河南鄭州，由河南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院藥劑科主管藥師趙婭鑒定為中華大蟾蜍的干燥皮。昆明小鼠，雌雄各半，18～22 g，購自河南省實驗動物中心。體積分數(shù)95%乙醇(分析純，鄭州光明化工有限公司)，RPMI 1640 培養(yǎng)基及胎牛血清(Gibco 公司)，胰蛋白酶(碧云天公司)，DMSO(Sigma Aldrich 公司)，MTT 試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。CO2細胞培養(yǎng)箱和水平流凈化工作臺(Thermo Forma 公司)，倒置顯微鏡(Olympus 公司)，高速低溫離心機(Beckman Coulte 公司)，Accuri C6 型流式細胞儀(BD 公司)，Power Wave XS2 酶標儀(BioTek 公司)，LE ICA RM 2235 型石蠟切片機(浙江省金華市益迪醫(yī)療設備廠)，DL80-2B 型離心機(上海安亭科學儀器廠)。

1．2 蟾皮中蟾毒噻嚀的提取 以無水乙醇為提取溶劑，采用響應面法研究超臨界CO2萃取干蟾皮中蟾毒噻嚀的最佳工藝條件為:萃取溫度45℃，萃取壓力40 MPa，CO2流量10 kg/h。在此條件下蟾毒噻嚀收率為2．36%，純度為98%。

1．3 蟾毒噻嚀對3種腫瘤細胞增殖的影響 收集對數(shù)生長期的細胞，用含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基調整細胞密度為8 ×104mL－1，每孔0．1 mL 接種于96 孔板，置37℃、體積分數(shù)5%CO2、飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)24 h。每種細胞均分為9組。將蟾毒噻嚀溶于DMSO 中，用培養(yǎng)基稀釋，使藥物終質量濃度為0．125、0．250、0．500、1．000、2.000、4．000、8．000、16．000、32．000 mg/L，對照組加入含體積分數(shù)0．1%DMSO 的無血清培養(yǎng)基［3］。繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，取出細胞培養(yǎng)板，每孔加入MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h 后每孔加入150 μL DMSO，并于562 nm 波長處測定各孔光密度值(OD值)。細胞抑制率=［(對照組OD 值－實驗組OD值)/對照組OD 值］×100%。根據不同質量濃度的藥物對細胞生長的抑制率，計算細胞的半數(shù)生長抑制濃度(IC50)。

1．4 蟾毒噻嚀對HepG2 細胞凋亡的影響 收集4、2、1 mg/L 蟾毒噻嚀處理過的HepG2 細胞約(1～5)× 106mL－1，即高、中、低劑量組，500～1 000 r/min 離心5 min，棄去培養(yǎng)液。3 mL PBS 洗滌1次。離心去PBS 后加入冰預冷的體積分數(shù)70%的乙醇4℃固定1～2 h。離心棄去固定液，3 mL PBS重懸5 min。400 目篩網過濾，500～1 000 r/min 離心5 min，棄去PBS。加入1 mL 混合后的PI 和Annexin-V FITC 染液，4℃避光染色30 min 后上流式細胞儀檢測［4-5］，觀察細胞凋亡和細胞周期分布。

1．5 蟾毒噻嚀對S180 荷瘤鼠腹水瘤的影響 凍存的S180 瘤株37℃水浴后1 000 r/min 離心5 min，棄上清，將下層細胞用無菌生理鹽水調節(jié)細胞密度至1 ×107mL－1。取小鼠，腹腔注射S180 細胞懸液0．3 mL。接種第7天，無菌條件下抽取S180 荷瘤小鼠腹腔中乳白色腹水3～5 mL，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，下層細胞用無菌PBS(pH 7．4)洗滌3次后，稀釋100 倍，加無菌生理鹽水調節(jié)細胞密度為1 ×107mL－1。在無菌操作下進行傳代。傳至第4代后抽取腹水，同上處理調整細胞密度為1 ×107mL－1。另取100只小鼠，腹腔注射上述細胞懸液0.3 mL 后按隨機數(shù)字表分為5組，陰性對照組每日注射0．01 mL/g 生理鹽水，陽性對照組注射20 mg/kg 5-FU，蟾毒噻嚀高、中、低劑量組分別注射30、20、15 mg/kg 蟾毒噻嚀，連續(xù)7 d。給藥期間，每天觀察荷瘤鼠的生存情況，隔天稱體重、測腹圍。

末次給藥后各組處死半數(shù)小鼠，在無菌條件下用注射器收集腹腔中全部腹水，測體積，計算腹水抑制率。腹水抑制率=［1 －治療組腹水量/陰性對照組腹水量］×100%。取新鮮腹水0．4 mL，1 000 r/min 離心5 min，棄去上層組織液，下層細胞用無菌PBS(pH 7．4)洗滌3次，稀釋100 倍，加入臺盼藍染液染色3 min(V臺盼藍染液∶V細胞懸液=1∶10)，用細胞計數(shù)板在光鏡下記錄細胞數(shù)，計算瘤細胞存活率。瘤細胞存活率=活細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。給藥結束后，未處死的半數(shù)小鼠觀察生存時間，計算生命延長率。生命延長率=［(給藥組生存時間/陰性對照組生存時間)－1］×100%。

剖取荷瘤鼠肝臟，中性甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋切片，HE 染色，普通顯微鏡下觀察肝組織的病理變化。

1．6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 16．0 處理數(shù)據。采用單因素方差分析比較不同劑量蟾毒噻嚀對3種腫瘤細胞的抑制率及各組荷瘤鼠腹水抑制率、瘤細胞存活率和生命延長率，兩兩比較采用SNK-q 檢驗，檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 蟾毒噻嚀對細胞增殖的影響 隨著藥物質量濃度的增大，蟾毒噻嚀對3種腫瘤細胞的抑制作用增強，其中對HepG2 細胞的抑制作用最強，結果見表1。蟾毒噻嚀對ECa109、HepG2、A549 細胞的IC50分別為(7．589 ±1．193)、(2．337 ±0．379)和(6.940 ±0．900)mg/L。

表1 不同劑量蟾毒噻嚀對3種腫瘤細胞的抑制率 %

2．2 蟾毒噻嚀對細胞凋亡的影響 根據MTT 實驗結果，選擇細胞抑制作用最顯著的HepG2 細胞觀察細胞凋亡和周期分布。結果顯示蟾毒噻嚀高、中、低劑量組凋亡細胞數(shù)均多于陰性對照組，且可將細胞周期阻滯在G2期。

2．3 各組荷瘤鼠生命延長率、腹水抑制率、瘤細胞存活率比較 見表2。

表2 各組荷瘤鼠生命延長率、腹水抑制率、瘤細胞存活率比較 %

2．4 肝臟組織學觀察 見圖1。剖取各組動物肝臟，肉眼可見肝臟顏色偏黃，各葉之間未見粘連，質地較堅韌，表面可見黏性物質，切面未見明顯充血、壞死灶等病理改變。鏡下見陰性對照組腫瘤組織內癌細胞數(shù)量多，排列緊密，異形性明顯，核大、深染，核漿比明顯異常，細胞出現(xiàn)空泡型變性，多數(shù)肝細胞壞死;各治療組腫瘤細胞浸潤程度較輕，異形細胞減少，肝臟細胞接近正常，見圖1。

圖1 各組荷瘤鼠肝臟的病理形態(tài)學表現(xiàn)(HE，×400)

3 討論

該研究主要觀察了蟾毒噻嚀的抗腫瘤作用。細胞實驗結果表明，蟾毒噻嚀對HepG2、A549、ECa109細胞均有較好的抑制作用，其中對肝癌HepG2 細胞的抑制作用最強。利用流式細胞術對細胞的凋亡和周期進行分析，發(fā)現(xiàn)蟾毒噻嚀能夠誘發(fā)肝癌HepG2細胞的凋亡，并初步推測其將細胞周期阻滯于G2期。

動物實驗［6］表明蟾毒噻嚀能明顯改善荷瘤鼠的生存狀態(tài)，延長荷瘤鼠的生存期。該研究結果顯示高、中劑量蟾毒噻嚀組小鼠腹水抑制率接近或高于5-FU組，蟾毒噻嚀各劑量組和5-FU組瘤細胞存活率均低于陰性對照組，且小鼠生存時間延長。病理切片的改變反映了腫瘤細胞在肝臟組織內的轉移［7］、擴散和侵襲。該研究結果顯示蟾毒噻嚀各劑量組和5-FU組的病理切片與正常肝臟接近，其原因可能與腹腔內腫瘤細胞的增殖受到抑制有關。

綜上所述，蟾毒噻嚀在細胞實驗中對HepG2、A549、ECa109 細胞均表現(xiàn)出抑制作用，可能與其促凋亡和周期阻滯作用有關;在動物實驗中可抑制S180 腹水瘤細胞生長，從而減少腹水形成，延長荷瘤鼠生存時間，對腹水引起的腹腔轉移癌有治療作用。

［1］曾洋，張愛軍，文筱．干蟾皮的研究進展［J］．中國醫(yī)藥科學，2011，1(15):29

［2］王元清，嚴建業(yè)，喻林華．蟾皮的化學成分與臨床應用研究進展［J］．時珍國醫(yī)國藥，2009，20(5):1213

［3］羅娟，許偉，薛天陽，等．苦參堿對人神經母細胞瘤SHSY5Y 細胞的作用機制［J］．實用兒科臨床雜志，2012，27(3):190

［4］孫凌飛，申文江．蟾皮提取液對腎癌細胞凋亡及Fas、FasL 和bcl-2 表達的影響［J］．中國醫(yī)藥導刊，2000，2(5):32

［5］張巍，趙行宇，李妍，等．不同濃度胡桃醌對Hela 細胞增殖及凋亡的影響［J］．解放軍醫(yī)學雜志，2013，38(2):99

［6］王婷婷，徐國興．華蟾素的藥理作用研究及臨床應用進展［J］．國際眼科雜志，2009，9(7):1330

［7］彭方慧，王峰，何煒，等．替吉奧與5-氟尿嘧啶聯(lián)合納達鉑治療晚期食管癌的療效比較［J］．鄭州大學學報:醫(yī)學版，2013，48(2):160