王 丹，彭 偉，李明珠，陳乃玲，穆 玉

1)河北聯(lián)合大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 唐山063000 2)廈門市口腔醫(yī)院牙體牙髓病科 廈門361000

△女，1980年11月生，碩士，主治醫(yī)師，講師，研究方向:牙周病的防治，E-mail:wang_dan1955@163．com

牙石和牙菌斑是牙周病最主要的局部刺激因素。齦下菌斑產(chǎn)生的大量內(nèi)毒素會侵入表層牙骨質(zhì)，即使通過齦下刮治和根面平整治療后，牙周膜細(xì)胞在牙根面的附著和生長仍會受到抑制，妨礙新纖維性附著的形成。如何有效去除毒素并形成具有良好生物相容性的根面成為牙周病治療的重點(diǎn)。成纖維細(xì)胞是牙周膜中最常見的細(xì)胞，其不斷形成新纖維，對牙周組織的修復(fù)十分重要。羧甲基殼聚糖(carboxymethyl chitosan，CMCS)是一種新型的殼聚糖衍生物，具有良好的生物相容性。溫敏凝膠是近年來出現(xiàn)的一類新型高分子智能材料，作為細(xì)胞及藥物載體支架在組織工程的研究領(lǐng)域已經(jīng)取得了顯著進(jìn)展。該研究中作者以和成纖維細(xì)胞生物學(xué)性質(zhì)極為相似的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH3T3［1］作為研究靶細(xì)胞，觀察CMCS 溫敏凝膠應(yīng)用于根面處理后的患牙根面后NIH3T3 細(xì)胞的附著和增殖情況，評價其在牙周新附著形成過程中是否有促進(jìn)作用。

1 材料與方法

1．1 材料 NIH3T3 細(xì)胞購自天津賽爾生物技術(shù)有限公司;DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶購自天津血液研究所;MTT、PBS、DMSO、乙二胺四乙酸(EDTA)、甘油磷酸鈉購自美國Sigma 公司;CMCS 購自青島海普生物有限公司。

1．2 樣本的選擇 收集因晚期牙周炎需拔除的炎癥患牙60 顆，患者年齡35～60歲。患牙標(biāo)準(zhǔn):帶有可見性牙石，探診深度≥5 mm，附著喪失≥6 mm，牙槽骨吸收至少到根尖1/3，近半年未行刮治術(shù)和根面平整治療，無全身疾病史。拔牙前記錄牙周袋頂?shù)奈恢?，拔除中確保不損傷根面，拔出后立即用無菌生理鹽水沖凈，放于新鮮配制的PBS 中，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3 CMCS 浸提液的制備 將取代度為0．3 的CMCS 消毒后稱取2．25 g 加入到45 mL 0．1 ×10－3mol/L 的無菌鹽酸溶液中，在(23 ±1)℃條件下溶解2 h，用G3 玻璃砂芯漏斗濾去未溶物，量取9 mL CMCS 濾液備用。稱取0．6 g 消毒后的甘油磷酸鈉溶解于1 mL 無菌超純水中，緩慢滴加到CMCS 濾液中，再繼續(xù)攪拌20 min 使二者均勻混合，即得CMCS/甘油磷酸鈉配合物溶液。將裝有CMCS/甘油磷酸鈉配合物溶液的試管置于30～70℃水浴中，達(dá)到初始凝膠化溫度后，恒溫一定時間，得到水凝膠。再將CMCS 溫敏凝膠按0．002 g/mL 的標(biāo)準(zhǔn)，37℃條件下放入到浸提介質(zhì)(含體積分?jǐn)?shù)10%FBS 的DMEM 完全培養(yǎng)基)中，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1．4 牙根片的制備 60 顆牙分為5組，按照分組情況分別采用手動刮治器械或超聲器械進(jìn)行刮治及根面平整，以去除肉眼可見的菌斑和牙石。于標(biāo)記處和結(jié)締組織附著處之間選擇較平的根面，在有冷水冷卻的條件下使用高速切割機(jī)縱行切下牙根表層，從髓腔側(cè)向牙骨質(zhì)側(cè)方向均勻磨除牙根片至1 mm 厚，保證牙骨質(zhì)側(cè)完好，制備出5 mm×5 mm×1 mm 大小的牙根片60個，放入雙抗溶液(青霉素、鏈霉素濃度均為100 U/mL)中浸泡24 h，再在無菌條件下放入培養(yǎng)皿內(nèi)置于紫外燈下4 h，隨即放入加有雙抗的PBS 中24 h，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．5 實(shí)驗分組 60個牙根片分為5組，每組12個。A組:超聲刮治+EDTA 處理3 min +CMCS 浸提液涂擦牙根表面5 min;B組:超聲刮治+ EDTA處理3 min +無菌生理鹽水涂擦牙根表面5 min;C組:手動刮治+EDTA 處理3 min +CMCS 浸提液涂擦牙根表面5 min;D組:手動刮治+ EDTA 處理3 min+無菌生理鹽水涂擦牙根表面5 min;E組(對照組):EDTA 處理3 min +無菌生理鹽水涂擦牙根表面5 min。處理后的牙根片分別放入3 塊24 孔板內(nèi)，牙骨質(zhì)面朝上，每組4個孔，每孔加入1 mL 含體積分?jǐn)?shù)10%FBS 的培養(yǎng)基，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中2 h。

1．6 NIH3T3 細(xì)胞在根面附著和增殖的觀察 取出24 孔板，吸棄孔內(nèi)的培養(yǎng)液。另取生長良好的小鼠NIH3T3 細(xì)胞，經(jīng)2．5 g/L 的胰蛋白酶消化，104r/min 離心5 min 后棄上清液，再加入含有體積分?jǐn)?shù)10%FBS 和雙抗的DMEM 培養(yǎng)基反復(fù)吹打，制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1 ×105mL－1，接種于24 孔板內(nèi)，每孔1 mL，放回培養(yǎng)箱中，使牙根片與NIH3T3 共同孵育，以求細(xì)胞附著生長于牙根片上，16 h 后，取1 塊24 孔板，吸棄孔內(nèi)液體，將牙根片上附著的細(xì)胞以胰蛋白酶消化后制備細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù);共孵育24 h，再取1 板，制備成單細(xì)胞懸液后以1 ×105mL－1的細(xì)胞密度接種于96 孔板內(nèi)，每組6 孔，待細(xì)胞貼壁后MTT 法檢測OD 值;共孵育72 h，取出最后1 塊24 孔板，處理同24 h。

1．7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17．0 處理數(shù)據(jù)。孵育24 和72 h 時5組細(xì)胞OD 值的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q 檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

NIH3T3 細(xì)胞在牙根片上孵育16 h 后，A、B、C、D、E組細(xì)胞數(shù)分別為(1．53 ±0．06)×105、(0．79 ±0．05)×105、(1．25 ±0．06)×105、(0．45 ±0．07)×105，E組細(xì)胞數(shù)量少于A、B、C、D組。共孵育24、72 h 時各組細(xì)胞OD 值比較見表1。

表1 牙片上各組NIH3T3 細(xì)胞的OD 值比較(n=4)

3 討論

臨床上治療牙周病的常用方法是在潔治術(shù)后使用更加精細(xì)的器械進(jìn)行齦下刮治和根面平整，常用器械一般分為手用和超聲兩種。丁一等［2］對手動和超聲方法刮治后的病變牙根進(jìn)行了掃描電鏡觀察，結(jié)果證實(shí)，兩種方法都是去除根面感染物質(zhì)的有效方法。該實(shí)驗亦證實(shí)應(yīng)用手動還是超聲處理根面對成纖維細(xì)胞在病變根面的附著生長及增殖的影響不大。EDTA 作為效果較好、副作用較小的根面處理劑，在實(shí)驗中保證了干預(yù)條件一致，使所有牙根片表面盡量去除化學(xué)玷污層，暴露膠原，有利于細(xì)胞的附著生長。

CMCS 是一類生物學(xué)性質(zhì)安全、穩(wěn)定的新型生物材料。莊昭霞和李巖等［3-4］經(jīng)體外細(xì)胞實(shí)驗證明CMCS 對牙周膜細(xì)胞具有良好的促進(jìn)增殖和骨向分化作用;此外，CMCS 還具有抑制口腔內(nèi)重要厭氧菌生長［5］的優(yōu)點(diǎn)。將CMCS 與甘油磷酸鈉互配制成CMCS 溫敏凝膠，當(dāng)溫度達(dá)到35～37℃時可迅速變成水凝膠，通過注射的方式可將其置于需要的部位，且降解產(chǎn)物無毒副作用，因此不需二次手術(shù)取出植入材料，符合牙周病治療的應(yīng)用要求，操作簡單，前景廣闊。

作者前期的實(shí)驗［6］已證實(shí)，CMCS 溫敏凝膠具有促進(jìn)NIH3T3 細(xì)胞增殖和分化的作用。該研究中作者進(jìn)一步觀察了它是否有利于NIH3T3 細(xì)胞在根面處理后的病變牙根片上附著和增殖。結(jié)果顯示，培養(yǎng)初期(16 h)NIH3T3 細(xì)胞在各組牙根片上已經(jīng)開始附著生長，刮治和根面平整過的牙根片上生長的細(xì)胞較未處理的牙根片上細(xì)胞多，說明有效的刮治利于細(xì)胞的附著生長;MTT 法結(jié)果證實(shí)，在培養(yǎng)24、72 h 時，進(jìn)行根面處理和使用CMCS 溫敏凝膠的各組細(xì)胞數(shù)多于對照組;而超聲或者手動的方法處理根面后，細(xì)胞的附著和增殖情況并無明顯差異，說明二者都是有效的根面處理方法，但是聯(lián)合使用CMCS 溫敏凝膠浸提液后，細(xì)胞的增殖情況優(yōu)于聯(lián)合使用無菌生理鹽水，提示在有效的根面平整后使用CMCS 溫敏凝膠可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，CMCS 溫敏凝膠在牙周組織再生領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。

［1］武影，張秀麗，束蓉．EDTA 對人牙周膜細(xì)胞在病變根面附著和增殖影響［J］．實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2005，21(4):554

［2］丁一，胡琳，劉國良．超聲和手用器械齦下潔治后牙根面的掃描電鏡觀察［J］．牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，1997，7(1):38

［3］莊昭霞，林志勇，曹金芳．殼聚糖-羧甲基殼聚糖膜的生物相容性研究［J］．上?？谇会t(yī)學(xué)，2003，12(5):362

［4］李巖．甲殼素及衍生物對NIH3T3 細(xì)胞和人牙周膜細(xì)胞增殖的影響［D］．石家莊:河北醫(yī)科大學(xué)，2005．

［5］唐濤，薛毅，信玉華，等．羧甲基殼聚糖對口腔重要厭氧菌的抑菌性能評價［J］．中國微生態(tài)學(xué)雜志，2003，15(6):337

［6］陳乃玲，穆玉，李明珠，等．羧甲基殼聚糖溫敏凝膠對NIH3T3 細(xì)胞增殖、骨化分化的影響［J］．鄭州大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2014，49(4):540