何曉梅，沈濤濤，陳壯壯，張 穎

（1.皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安237012；2.植物細(xì)胞工程安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 六安237012）

皖西地處大別山腹地，是我國(guó)重要的江北茶區(qū)，境內(nèi)氣候溫和，雨量充沛，植被條件良好，森林覆蓋率高，土壤多屬山地黃棕壤，有機(jī)質(zhì)豐富，結(jié)構(gòu)良好，所產(chǎn)茶葉內(nèi)含物豐富。名優(yōu)茶品種繁多，有六安瓜片、霍山黃芽、舒城小蘭花、金寨翠眉、霍山菊花茶、小峴春等。而名優(yōu)茶產(chǎn)量只占茶葉總產(chǎn)量的20%左右，中低檔茶葉和粗老茶葉得不到充分利用，造成極大浪費(fèi)。茶多糖是一類從茶葉中提取出來的多糖類化合物，具有增強(qiáng)免疫力、降血脂、降血糖、抗輻射、抗凝血、抗血栓等功效，具有多種藥理作用［1］。據(jù)研究，茶葉越粗老，其茶多糖含量越高［2-3］。目前對(duì)皖西粗老綠茶茶多糖提取研究未見報(bào)道，若能從皖西粗老綠茶中提取茶多糖并制成保健品，對(duì)于皖西粗老茶葉的綜合利用具有較大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

本研究以皖西粗老綠茶為原料，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化茶多糖的提取工藝，以期得到最佳提取工藝參數(shù)，為皖西茶葉茶多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮粗老綠茶，安徽一笑堂茶業(yè)有限公司提供。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要儀器

智能型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，電子分析天平（1／1000），SHJ-A4水浴磁力攪拌器，RE-2000E 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，SHB-Ⅲ型臺(tái)式循環(huán)水式多用真空泵，GL-21M大型冷凍離心機(jī)，TU-1901紫外可見分光光度計(jì)。

1.2.2 主要試劑

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、苯酚、濃硫酸，均為國(guó)產(chǎn)分析純，水為二次蒸餾水。

1.2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品25.00mg，置于25mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用。

1.2.2.2 6%苯酚溶液的配制

取重蒸酚80.00g加蒸餾水20mL溶解，搖勻，置棕色瓶于4℃冰箱保存，臨用前用80%苯酚溶液加蒸餾水稀釋配制而成。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 綠茶茶多糖的浸提

將含有綠茶粉末的濾紙包置于索氏提取器中，用石油醚回流脫脂，晾干。然后準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量綠茶粉末于三角燒瓶中，按一定水茶比加入蒸餾水，在一定溫度下浸提一定時(shí)間，抽濾，離心，測(cè)定浸提液中茶多糖含量。

1.3.2 茶多糖提取率計(jì)算

采用苯酚—硫酸法制備葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線［4］。精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL置于20mL具塞試管中，各加蒸餾水至2.0mL，依次加入6%苯酚溶液1.0mL，濃硫酸5.0mL，搖勻，靜置20min后測(cè)OD490nm值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。由圖1得回歸曲線方程為：y＝15.668x，R2＝0.9994。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

茶多糖提取率計(jì)算：取茶多糖提取液1mL同標(biāo)準(zhǔn)曲線制備操作步驟，測(cè)OD490nm值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品濃度（C樣品）。根據(jù)下列公式計(jì)算茶多糖提取率（%）。

茶多糖提取率（%）＝ ［（C樣品×提取液總體積×換算因子［5］）／（茶樣質(zhì)量×103）］×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 浸提時(shí)間對(duì)茶多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5.000g脫脂綠茶粉末，選取水茶比為30∶1，浸提溫度為80℃，浸提時(shí)間為1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h（每個(gè)水平進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)，以下同），按照1.3.1的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2。

由圖2可知，隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，茶多糖提取率呈上升趨勢(shì)，但增加幅度不大。考慮到浸提時(shí)間越長(zhǎng)，茶葉中其他水溶性成分越容易擴(kuò)散出來，另外耗費(fèi)能源也越多，故選用浸提時(shí)間為2h。

2.1.2 浸提溫度對(duì)茶多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5.000g脫脂綠茶粉末，選取水茶比為30∶1，浸提時(shí)間為2h，浸提溫度為50℃、60℃、70℃、80℃、90℃，按照1.3.1的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3。

圖2 浸提時(shí)間對(duì)茶多糖提取率的影響

圖3 浸提溫度對(duì)茶多糖提取率的影響

由圖3可知，浸提溫度在50～80℃時(shí)，隨著浸提溫度的升高，茶多糖的得率增加明顯；超過80℃時(shí)，隨著溫度的升高，茶多糖得率增加幅度減緩?？紤]到高溫可能會(huì)破壞茶多糖的結(jié)構(gòu)，影響其生物活性，故采用浸提溫度為80℃。

2.1.3 水茶比對(duì)茶多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5.000g脫脂綠茶粉末，選取浸提溫度為80℃，浸提時(shí)間為2h，水茶比為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1，按照1.3.1的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖4。

圖4 水茶比對(duì)茶多糖提取率的影響

由圖4可知，隨著水茶比的增大，茶多糖提取率逐漸增加，其中水茶比從10∶1增加到20∶1時(shí)，茶多糖提取率增加明顯。隨著水茶比例的增加，提取液過濾、濃縮時(shí)間大大增加，考慮到節(jié)約時(shí)間和成本，故采用水茶比為20∶1。

2.1.4 浸提次數(shù)對(duì)茶多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5.000g脫脂綠茶粉末，選取浸提溫度為80℃，浸提時(shí)間為2h，水茶比為20∶1，按照1.3.1的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖5。

圖5 浸提次數(shù)對(duì)茶多糖提取率的影響

由圖5可知，隨著浸提次數(shù)的增加，茶多糖總提取率增加，但第2至第4次浸提液中茶多糖含量都較少，所以在后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，只進(jìn)行一次浸提。

2.2 二次響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)Box-Behnken Design試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取浸提時(shí)間、浸提溫度、水茶比作為考察因素，浸提液中茶多糖提取率作為因變量，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析［6］。Box-Behnken設(shè)計(jì)的方案及結(jié)果見表1和表2。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素及編碼水平

利用Design-Expert軟件對(duì)表2的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到茶多糖提取率Y與各自變量關(guān)系的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y＝4.65＋0.14A＋0.36B＋0.19C-0.067AB-0.037AC＋0.091BC-0.15A2-0.18B2＋0.056C2

由回歸方程的方差分析（表3）可知，實(shí)驗(yàn)所選用模型P值為0.0003（P＜0.01），極顯著。而且 A、B、C、A2、B2各項(xiàng)都表現(xiàn)顯著或極顯著，說明回歸模型具有較好的擬合度，能較好地反映茶多糖的浸提率與各選擇因素不同水平之間的量效關(guān)系。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 回歸方程的方差分析

利用Design-Expert軟件對(duì)茶多糖得率進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬，得到各因素取最優(yōu)值（浸提時(shí)間2.06h、浸提溫度90℃、水茶比30∶1）后的響應(yīng)所能取得的最大值為5.171%，與實(shí)驗(yàn)條件（浸提時(shí)間2.0h、浸提溫度90℃、水茶比30∶1）所得實(shí)驗(yàn)值5.081%相差較小，因此Design-Expert軟件所得的最優(yōu)條件可以作為茶多糖浸提的條件。

3 結(jié)論

以水為提取溶劑，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)和Design-Expert分析軟件確定茶多糖的最佳浸提條件為浸提時(shí)間2.06h、浸提溫度90℃、水茶比30∶1、浸提1次，茶多糖最高浸提率為5.171%。

實(shí)驗(yàn)所得浸提溫度為90℃，與參考文獻(xiàn)［7］相比偏高，較高的溫度是否影響茶多糖的結(jié)構(gòu)和活性有待進(jìn)一步研究。

［1］陳義勇，竇祥龍，黃友如，等.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲-微波協(xié)同輔助提取茶多糖工藝［J］.食品科學(xué)，2012，33（4）：100-103.

［2］陳建國(guó)，胡欣，梅松.茶葉中茶多糖的提取和測(cè)定方法［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2004，14（4）：432-433.

［3］汪東風(fēng)，謝曉鳳，王澤農(nóng)，等.粗老茶中的多糖含量及其保健作用［J］.茶葉科學(xué)，1994，14（1）：73-74.

［4］傅博強(qiáng)，謝明勇，聶少平，等.茶葉中多糖含量的測(cè)定［J］.食品科學(xué)，2001，22（11）：69-73.

［5］張惟杰.復(fù)合多糖生化研究技術(shù)［M］.上海：上海科技出版社，1987.

［6］Giovinni M.Response Surface Methodology and Product Optimization［J］.Food Technology，1982，37（9）：41-45.

［7］原龍，范泳，徐文芳.綠茶中提取茶多糖最佳工藝的優(yōu)化［J］.食品工業(yè)科技，2010，31（5）：255-256.