魏 明 涂 玲 梁穎紅 劉 佳 張俊華 龔艷杰 (鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 鄭州 450052)

在腫瘤的治療中，目前困擾臨床醫(yī)生的主要問(wèn)題仍是腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。為此本研究采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)對(duì)不同臨床分期和類型的肺癌患者外周血CEA mRNA、CK19 mRNA和CK20 mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，探討其對(duì)肺癌微轉(zhuǎn)移診斷和監(jiān)測(cè)的臨床意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 肺癌患者60例，男46例，女14例。平均年齡57.8歲，均經(jīng)病理組織切片確診。其中小細(xì)胞肺癌10例，腺癌22例，鱗癌28例;Ⅰ～Ⅱ期12例，Ⅲ期30例，Ⅳ期18例。肺良性病變組42例，男28例，女14例，平均年齡56.7歲，其中肺大泡21例，支氣管擴(kuò)張21例。健康對(duì)照組60名，男45例，女15例，平均年齡57.1歲，均為健康體檢者。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 外周血RNA的提取:采集受檢者EDTA抗凝血5 ml，用QiaAmp試劑盒(美國(guó) Qiagen公司)，按試劑盒說(shuō)明書提取全血RNA，凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 熒光定量PCR檢測(cè)CEA mRNA、CK19 mRNA和CK20 mRNA CEA mRNA、CK19 mRNA和 CK20 mRNA熒光定量PCR試劑盒由浙大生科公司提供。引物:CEA mRNA上游引物序列:5＇-TAG CTA CTT ACT ACT TAC TAC TCC T-3＇，下游引物序列:5＇-CTT TTG TCC CGG CAC ATC GGG C-3＇，探針序列:5＇-TGT ATC GGG ACG TGC ACA AAG ACA G-3＇;CK19 mRNA 上游引物序列:5＇-GGA GAC GCC GGT GGA GTA TCG-3＇，下游引物序列:5＇-CAG GAA CAC GTT GCA CGA TAG-3＇，探針序列:5＇-CCG ATG GGG ATT TAT ACT A-3＇;CK20 mRNA 上游引物序列:5＇-CAT GGA CAT GCT GCA CTT TAG-3＇，下游引物序列:5＇-GCT CGG CAT CCA GAG TCA GGG-3＇，探針序列:5＇-TAG CTA CTI＇ACT TAC TAC TCC T-3＇。cDNA 合成用 Promega公司逆轉(zhuǎn)錄試劑(反應(yīng)緩沖液 0.1 mol DTT，10 mmol dNTP，Rnasin，Oligodt，M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶)20 μl，加 2 μl RNA 提取液，37℃ 水浴60 min，95℃ 3 min。PCR擴(kuò)增50 μl PCR反應(yīng)體系中，包括5×PCR 緩沖液10 μl，上下游引物各 16 pmol，熒光探針 10 pmol，Taq 酶 3 U，10 mmol/L dNTP 1 μl，cDNA 5 μl，在 Roche 公司Light Cycler PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min，94℃10 s，65℃20 s，72℃30 s，共 40 個(gè)循環(huán)。

1.4 結(jié)果判斷 以去離子水稀釋109拷貝/ml標(biāo)準(zhǔn)品，依次稀釋拷貝數(shù)為每毫升 1×106、1×105、1×104、1×103、1×102的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，經(jīng)熒光定量擴(kuò)增后，由儀器軟件自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到各檢測(cè)標(biāo)本的濃度。以濃度＞500拷貝/ml為陽(yáng)性結(jié)果，濃度＜500拷貝/ml為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS12.0軟件進(jìn)行t和χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 CEA mRNA、CK19 mRNA和CK20 mRNA在肺癌患者外周血中的表達(dá)水平和陽(yáng)性率比較 肺良性病變組CEA mRNA、CK19 mRNA均為陰性，CK20 mRNA陽(yáng)性1例;健康對(duì)照組CEA mRNA、CK19 mRNA和CK20 mRNA均為陰性，肺癌組與肺良性病變組和健康對(duì)照組比較，上述3項(xiàng)組織特異性mRNA表達(dá)水平和陽(yáng)性率差異顯著(P＜0.01)，肺良性病變組和健康對(duì)照組比較，上述3項(xiàng)組織特異性mRNA表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 不同類型肺癌患者外周血中CEA mRNA、CK19 mRNA和CK20 mRNA的表達(dá)水平和陽(yáng)性率比較 見表1。

2.3 不同臨床分期肺癌患者外周血CEA mRNA、CK19 mRNA和CK20 mRNA的表達(dá)水平比較 I～Ⅱ期肺癌患者外周血中有陽(yáng)性表達(dá)，Ⅲ、Ⅳ期CEA mRNA、CK19 mRNA的表達(dá)水平顯著高于 I～Ⅱ期(P＜0.05)，Ⅲ、Ⅳ期 CEA mRNA、CK19 mRNA、CK20 mRNA的陽(yáng)性率和表達(dá)水平明顯高于 I～Ⅱ期(P＜0.05)。見表 2。

表1 不同類型肺癌患者外周血中CEA mRNA、CK19 mRNA和CK20 mRNA的表達(dá)(拷貝/ml，s)

表1 不同類型肺癌患者外周血中CEA mRNA、CK19 mRNA和CK20 mRNA的表達(dá)(拷貝/ml，s)

與小細(xì)胞肺癌和鱗癌組比較:1)P＜0.05

肺癌類型 n CEA mRNA CK19 mRNA CK20 mRNA陽(yáng)性〔n(%)〕 水平 陽(yáng)性〔n(%)〕 水平 陽(yáng)性〔n(%)〕 水平小細(xì)胞肺癌 10 2(20.0)2 466±4 165 3(30.0)10 892±24 657 2(20.0)8 283±15 262腺癌 22 14(63.6)28 607±43 4521) 9(41.0)1) 13 874±29 950 8(36.4)1) 11 866±22 3751)鱗癌 28 10(35.7)1) 8 488±15 3881) 15(53.6)1) 19 583±38 4631) 10(35.7)1) 11 075±20 4801)

表2 不同分期肺癌患者外周血中CEA mRNA、CK19 mRNA和CK20 mRNA的表達(dá)(拷貝/ml，s)

表2 不同分期肺癌患者外周血中CEA mRNA、CK19 mRNA和CK20 mRNA的表達(dá)(拷貝/ml，s)

與Ⅰ～Ⅱ期比較:1)P＜0.05

肺癌臨床分期 n CEA mRNA CK19 mRNA CK20 mRNA陽(yáng)性〔n(%)〕 水平 陽(yáng)性〔n(%)〕 水平 陽(yáng)性〔n(%)〕 水平Ⅰ ～ Ⅱ期 12 4(33.3)4 708±8 264 4(33.3)3 837±6 817 4(33.3)6 491±8 352Ⅲ期 30 19(63.3)1) 16 598±28 7851) 18(60.0)1) 15 052±2 6981) 13(43.3)1) 8 746±18 9031)Ⅳ期 18 12(66.7)1) 21 567±30 5681) 8(77.8)1) 18 807±21 8281) 8(44.4)1) 12 976±25 9651)

2.4 聯(lián)合檢測(cè)CEA mRNA、CK19 mRNA和CK20 mRNA對(duì)診斷肺癌微轉(zhuǎn)移的敏感性、準(zhǔn)確性比較 CEA mRNA、CK19 mRNA和CK20 mRNA對(duì)肺癌患者有很高的特異性和較好的敏感性，聯(lián)合兩項(xiàng)檢測(cè)準(zhǔn)確性和敏感性明顯提高，聯(lián)合三項(xiàng)檢測(cè)準(zhǔn)確性為88.9%，敏感性為80.0%，見表3。

表3 CEA mRNA、CK19 mRNA和CK20 mRNA聯(lián)合檢測(cè)的意義〔%(n/n)〕

3 討論

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)已被用于檢測(cè)實(shí)體瘤微轉(zhuǎn)移細(xì)胞中組織特異mRNA的表達(dá)。該方法具有很高的敏感度，每105～107個(gè)正常有核細(xì)胞中含1～10個(gè)癌細(xì)胞即可檢測(cè)出來(lái)〔1～4〕。CEA mRNA、CK19 mRNA和CK20 mRNA是特異性較高的腫瘤相關(guān)抗原，很大一部分肺癌患者可有它們蛋白的表達(dá)。單獨(dú)檢測(cè)某一腫瘤標(biāo)志物基因存在兩個(gè)問(wèn)題，一是陽(yáng)性率不高，二是特異性不強(qiáng)，因此本研究采用熒光定量RT-PCR方法對(duì)CEA mRNA、CK19 mRNA和CK20 mRNA三個(gè)組織特異性mRNA進(jìn)行了聯(lián)合檢測(cè)。本研究結(jié)果提示聯(lián)合檢測(cè)這3個(gè)指標(biāo)可作為判斷肺癌血源性微轉(zhuǎn)移的輔助指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Peck等〔5〕相似，提示Ⅰ、Ⅱ期肺癌患者可能已有血源性微轉(zhuǎn)移。對(duì)這部分患者首選除手術(shù)外是否加用手術(shù)期化療，但尚需選擇更多的I～Ⅱ期患者來(lái)長(zhǎng)期跟蹤觀察。隨病情發(fā)展腫瘤細(xì)胞發(fā)生血行轉(zhuǎn)移的可能性更大。部分Ⅲ、Ⅳ期肺癌患者這3個(gè)指標(biāo)出現(xiàn)陰性的原因可能性有:(1)形成定植性轉(zhuǎn)移灶后，血循環(huán)中腫瘤細(xì)胞數(shù)量反而減少。(2)腫瘤細(xì)胞釋放入血的時(shí)間不同，單點(diǎn)檢測(cè)可產(chǎn)生偏倚、有條件可多次抽血檢測(cè)。(3)該方法的檢測(cè)敏感性有待于進(jìn)一步提高〔6〕。

綜上，應(yīng)用熒光定量RT-PCR檢測(cè)肺癌患者外周血CEA mRNA、CK19 mRNA和CK20 mRNA是反映腫瘤細(xì)胞血源性播散較靈敏的指標(biāo)。聯(lián)合二至三項(xiàng)指標(biāo)能提高肺癌微轉(zhuǎn)移檢測(cè)的敏感性和準(zhǔn)確性。當(dāng)然，血循環(huán)中癌細(xì)胞的存在最終能否發(fā)展為腫瘤還受機(jī)體免疫及其他因素的調(diào)控，為此需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪。

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