吳敏琳，孫小琳，朱莎莎，李衛(wèi)東，白根本

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京100102)

金銀花(Lonicera japonica Thunb)又名忍冬，為忍冬科忍冬屬植物［1］，具有清熱解毒、涼散風(fēng)熱、廣譜抗菌及抗病毒等功效，臨床上治療濕病發(fā)熱、風(fēng)熱感冒、咽喉腫痛、肺炎等多種疾病，有“中藥之中的青霉素”之稱［2-3］?！侗静菥V目》記載“忍冬，莖葉及花，功用皆同”。金銀花在其道地產(chǎn)區(qū)山東已有300余年的栽培歷史，長(zhǎng)期的自然選擇與人工選擇，金銀花的種質(zhì)發(fā)生了明顯的變異與分化，形成的種質(zhì)形態(tài)、產(chǎn)量及質(zhì)量均存在較大差異［4-5］。有機(jī)酸類被認(rèn)為是金銀花清熱解毒的藥理基礎(chǔ)，其中常以綠原酸(chlorogenic acid，CGA)作為金銀花的質(zhì)量控制指標(biāo)［6］。而目前公認(rèn)的綠原酸合成途徑有3條，經(jīng)研究表明，通過HQT(hydroxycinnamoyl CoA quinate hydroxycinnamoyl transferase)合成綠原酸的途徑為其主要合成途徑［7］。HQT功能基因的變異可通過改變其蛋白活性來調(diào)控綠原酸的生物合成效率。本文擬從不同金銀花品種中克隆HQT基因編碼區(qū)序列，通過多重序列比對(duì)，揭示金銀花HQT基因變異并按其編碼氨基酸的差異進(jìn)行分類，再結(jié)合其綠原酸含量的變化，闡明金銀花HQT基因的與綠原酸生物合成的關(guān)系。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 植物材料 研究所用的12個(gè)忍冬品種(見表1)，分別來自山東、河北、河南等金銀花主要栽培區(qū)。試驗(yàn)材料均采自山東平邑九間棚公司金銀花種質(zhì)資源收集圃。

表1 金銀花樣品

1.2 試劑 RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen-Sample＆Assay Technologies)，SuperScript?VILOTMcDNA Synthesis Kit、AccuPrimeTMPfx Super Mix(Lifetechologies)，100 bp Plus II DNA Ladder(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，綠原酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，生產(chǎn)批號(hào)為11075-200413)。

1.3 儀器 SIGMA 3K-15低溫高速離心機(jī)(Sigma);凝膠成像分析儀(BIO-RAD)，DYY-6C電泳儀、水平電泳槽(北京市六一儀器廠)，SANYO－80℃超低溫冰箱、制冰機(jī)(SANYO)，GeneAmp9600 PCR儀(Applied Biosystems)，DHG-9053A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司)，KQ-300VDE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，BP211S電子天平(Sartorius)，高效液相色譜儀(Waters)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 采用Qiagen公司的RNA提取試劑盒提取各樣品的總RNA，1.2%瓊脂糖變性膠電泳檢測(cè)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系步驟如下:在微量離心管中配制20 μL混合液，包含模板RNA 2.5 μg，5X VILO［TM］Reaction Mix 4 μL，10X SuperScript?Enzyme Mix 2 μL，DEPC-treated water up to 20 μL。25℃保溫10 min，42 ℃保溫60 min，85 ℃保溫5 min，產(chǎn)物于－20℃保存。

2.2 PCR擴(kuò)增HQT基因編碼區(qū)序列 根據(jù)金銀花HQT基因編碼區(qū)的 cDNA序列［8］，用 Primer Primer 5.0軟件在cDNA末端設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增金銀花HQT基因編碼區(qū)，引物序列如下，上游引物HQT-F:CATGCCATGGCTATGGGAAGTGAAGGAAGTGTGAA;下游引物 HQT-R:TCCCCCGGGTCAGAACTCGTACAAACACTTCTCAAA。PCR 反應(yīng)體系(25 μL):AccuPrime PfxSuper Mix 22.5 μL，F(xiàn)orward and reverse primers(10 μmol)1 μL，Template DNA solution(10 pg – 200 ng)0.5 μL。PCR 反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s，58℃退火30 s，68℃延伸30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，4℃保存。

2.4 HQT基因編碼區(qū)序列的生物信息學(xué)分析 各樣本的測(cè)序結(jié)果用MEGA 5.0軟件分析，并輔以人工校對(duì)。利用NCBI的Blast功能進(jìn)行序列相似相比較，利用MEGA 5.0軟件對(duì)HQT基因序列進(jìn)行聚類進(jìn)化分析。

2.5 綠原酸含量測(cè)定及方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 色譜條件 色譜柱為Agilent C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.4% 磷酸(13∶87)，進(jìn)樣量為5 μL，流速 1 mL/min，柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm。

2.5.2 對(duì)照品溶液及供試品溶液制備［9］對(duì)照品溶液制備:精密稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品2.55 mg，加入50%甲醇配制終濃度為0.051 mg/mL的對(duì)照品溶液。供試品溶液制備:精密稱取金銀花樣品粉末0.1 g(過藥典4號(hào)篩)，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加50%的甲醇20 mL，超聲(270 W，45 kHz)30 min，放冷后稱定補(bǔ)重，搖勻后過濾，精密量取續(xù)濾液10 mL，置25 mL量瓶中，加50%甲醇定容。

2.5.3 線性試驗(yàn) 按照2.5.1項(xiàng)下的色譜條件，將2.5.2項(xiàng)下配制的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)樣2，4，6，8，10 μL，記錄峰面積。

2.5.4 樣品含量測(cè)定 取不同樣品按供試液制備方法制樣并測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算綠原酸的含量。

2.5.5 精密度試驗(yàn) 取同一份對(duì)照品溶液，按照設(shè)定的色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次測(cè)定。

2.5.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同批樣品(九豐一號(hào))6份，按供試液制備方法制樣并測(cè)定。

2.5.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液(九綠一號(hào))，分別在 0，1，2，4，8，12，24 h 時(shí)測(cè)定含量。

催化燃燒熱空氣脫附法是采用催化燃燒反應(yīng)后的熱氣體（控制溫度）加熱吸附床，脫附出來的有機(jī)氣體進(jìn)入催化燃燒階段凈化處理，從而脫附凈化。催化燃燒脫附法所需催化劑的費(fèi)用較高，并且具有一定的安全隱患。

2.5.8 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的供試品(九綠一號(hào))6份，分別加入6組不同量的綠原酸對(duì)照品，按供試液制備方法制樣并測(cè)定，每一水平測(cè)定3次。

3 結(jié)果與分析

3.1 HQT基因的測(cè)序 從12種金銀花樣品中PCR得到了7條HQT基因cDNA編碼序列，長(zhǎng)度約1 300 bp。按樣品編號(hào)分別將這12條序列編號(hào)為1～12，12條序列一致度為98.3% ～100%。利用NCBI的BLAST進(jìn)行序列相似性比較，與金銀花HQT基因序列［7］(GenBank accession:GQ847546)相 似 性 大 于98%，確定了獲得的cDNA片段為金銀花HQT基因的cDNA片段。

3.2 HQT基因編碼區(qū)序列的變異分析 對(duì)12條HQT基因的編碼區(qū)序列進(jìn)行分析，變異情況見表2。

表2 金銀花HQT基因編碼序列變異

對(duì)表2進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)HQT基因序列中主要存在以下2種情況的突變，1)單核苷酸多態(tài)性(SNPs):進(jìn)行比對(duì)的12條HQT基因，其編碼區(qū)共有24處SNPs，如在360 bp處的T-A轉(zhuǎn)換，410 bp處的A-C顛換。2)插入/缺失突變:在1～6 bp的位點(diǎn)上，3號(hào)樣本存在ATGGCT 6個(gè)堿基的插入，但是未引起移碼突變，開放閱讀框完整，為1 326 bp，比其它序列開放閱讀框長(zhǎng)度增加6 bp。

3.3 HQT氨基酸序列多態(tài)性分析 利用MEGA 5.0軟件將12條核酸序列翻譯成對(duì)應(yīng)的氨基酸，得到長(zhǎng)439～441的HQT蛋白氨基酸序列，變異情況見表3。對(duì)表3進(jìn)行分析，共發(fā)現(xiàn)在4個(gè)位點(diǎn)氨基酸發(fā)生了突變，其中3號(hào)樣品存在一處由2個(gè)氨基酸插入引起的突變，這一突變使得3號(hào)樣品的起始密碼子提前，比其他樣品氨基酸序列多了2個(gè)氨基酸殘基。

表3 金銀花HQT蛋白的氨基酸序列變異

3.4 綠原酸含量測(cè)定與方法學(xué)驗(yàn)證

3.4.1 線性 以進(jìn)樣量為縱坐標(biāo)Y，峰面積為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.000 000 3 X+0.013 1，R2=0.999 7。表明綠原酸在0.102 ～0.510 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.4.2 樣品含量 每份樣品重復(fù)測(cè)定3次，取平均值，結(jié)果見表4。

表4 樣品綠原酸含量測(cè)定結(jié)果

3.4.3 精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、回收率 儀器精密度RSD=0.18%，說明儀器精密度良好。供試品溶液制備方法重現(xiàn)性RSD=1.76%，說明制備方法重現(xiàn)性高。樣品穩(wěn)定性RSD=0.84%，表明供試液中的待測(cè)組分在24 h內(nèi)是穩(wěn)定的。平均回收率=100.28%，RSD=0.11%(n=6)，以上驗(yàn)證結(jié)果說明實(shí)驗(yàn)方法和數(shù)據(jù)科學(xué)有效。

4 討論

目前公認(rèn)的綠原酸合成途徑有3條，其中通過HQT催化咖啡酰-CoA與奎尼酸生成綠原酸［10］的途徑是植物體內(nèi)合成綠原酸的主要途徑，本文在對(duì)金銀花HQT基因編碼區(qū)序列進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)其具有多態(tài)性。

按照表3中4個(gè)位點(diǎn)可將HQT基因的突變分為3個(gè)類型:類型Ⅰ，在第137、324位點(diǎn)分別是丙氨酸和纈氨酸;類型Ⅱ(3號(hào)樣品)，在第1、2位點(diǎn)分別是甲硫氨酸和丙氨酸;類型Ⅲ(4號(hào)樣品)，在第137、324位點(diǎn)分別是天冬氨酸和丙氨酸。結(jié)合表4的結(jié)果分析:類型Ⅱ綠原酸含量為1.20%，是所有實(shí)驗(yàn)樣品中含量最少的;類型Ⅲ綠原酸含量為1.89%，相對(duì)大多數(shù)品種其含量也較少;類型Ⅰ中各實(shí)驗(yàn)品種綠原酸含量均大于2%。綜合兩項(xiàng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HQT基因變異在一定程度上影響了其表達(dá)產(chǎn)物綠原酸的含量，證明了二者之間具有一定的相關(guān)性。

其中4號(hào)樣品的眾多突變證實(shí)了不同種類忍冬的HQT蛋白在基因水平上存在有明顯的差異;5號(hào)樣品為金銀花的變種(紅白忍冬)，其綠原酸含量明顯高于其他二倍體品種。以上兩點(diǎn)從不同層面上證明了忍冬分類的準(zhǔn)確性。

綠原酸含量之所以存在明顯的差異，除了基因變異造成的影響，還可能有多種因素的共同作用:如外部環(huán)境的影響，生長(zhǎng)在陽(yáng)坡的金銀花不同器官中綠原酸的含量均高于陰坡的同類樣品［11］;干旱、低溫以及病害感染，都可促使磷酸戊糖途徑的比重增大，使綠原酸含量增多［12］等。另外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果中5號(hào)樣品是四倍體，其綠原酸含量約為其他普通二倍體品種的2倍左右。由此可見綠原酸的積累有其復(fù)雜的生理學(xué)機(jī)制，還有待進(jìn)一步的具體研究。

本文對(duì)金銀花功能蛋白HQT進(jìn)行基因編碼區(qū)多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)HQT基因具有豐富的變異，其錯(cuò)義突變導(dǎo)致了HQT蛋白的改變，進(jìn)而導(dǎo)致了不同品種的樣品中綠原酸含量產(chǎn)生差異。本文發(fā)現(xiàn)了金銀花HQT基因編碼區(qū)和綠原酸含量及種間分類具有一定的相關(guān)性。為科學(xué)的利用和開發(fā)金銀花資源奠定理論基礎(chǔ)和提供科學(xué)手段，為以后的研究工作提供有價(jià)值的參考。

［1］黃麗瑛，呂植禎，李繼彪，等．中藥金銀花的化學(xué)成分研究［J］．中草藥，1996，27(11):195-196．

［2］劉恩荔．金銀花的研究進(jìn)展［J］．山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，37(3):331-334．

［3］劉丹．金銀花的研究進(jìn)展［J］．武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，14(1):78-80．

［4］張永清．山東金銀花生產(chǎn)情況調(diào)查［J］．山東中醫(yī)雜志，2000，19(10):621-624．

［5］周鳳琴，張永清，張芳，等．山東金銀花種質(zhì)資源的調(diào)查研究［J］．山東中醫(yī)雜志，2006，25(4):268-271．

［6］張守平，辛寧，柳萍．金銀花化學(xué)成分及質(zhì)量控制研究進(jìn)展［J］．中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2007，14(3):84-86．

［7］Niggeweg R，Michael A J，Martin C．Engineering plants with increased levels of the antioxidant chlorogenic acid［J］．Nat Biotechnol，2004，22:746-754．

［8］彭小?。疸y花的基因鑒定及其HQT基因的克隆與功能研究［D］．北京:北京中醫(yī)藥大學(xué)，2010:80．

［9］國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典［M］．北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:205．

［10］Rhodes M J C，Wooltorton L S C．The enzymatic conversion of hydroxycinnamic acids to p-coumaroyl quinic and chlorogenic acids in tomato［J］．Phytochem，1976，15:947-951．

［11］T．W．古德溫，E．I．默塞爾．植物生物化學(xué)導(dǎo)論［M］．楊陵:天則出版社，1988．

［12］鄭師章，倪德祥，周紀(jì)倫，等．若干金銀花中綠原酸含量的比較研究［J］．復(fù)旦學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，1978(1):111-115．