吳敏琳，孫小琳，朱莎莎，李衛(wèi)東，白根本

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京100102)

金銀花(Lonicera japonica Thunb)又名忍冬，為忍冬科忍冬屬植物［1］，具有清熱解毒、涼散風(fēng)熱、廣譜抗菌及抗病毒等功效，臨床上治療濕病發(fā)熱、風(fēng)熱感冒、咽喉腫痛、肺炎等多種疾病，有“中藥之中的青霉素”之稱［2-3］?！侗静菥V目》記載“忍冬，莖葉及花，功用皆同”。金銀花在其道地產(chǎn)區(qū)山東已有300余年的栽培歷史，長期的自然選擇與人工選擇，金銀花的種質(zhì)發(fā)生了明顯的變異與分化，形成的種質(zhì)形態(tài)、產(chǎn)量及質(zhì)量均存在較大差異［4-5］。有機酸類被認(rèn)為是金銀花清熱解毒的藥理基礎(chǔ)，其中常以綠原酸(chlorogenic acid，CGA)作為金銀花的質(zhì)量控制指標(biāo)［6］。而目前公認(rèn)的綠原酸合成途徑有3條，經(jīng)研究表明，通過HQT(hydroxycinnamoyl CoA quinate hydroxycinnamoyl transferase)合成綠原酸的途徑為其主要合成途徑［7］。HQT功能基因的變異可通過改變其蛋白活性來調(diào)控綠原酸的生物合成效率。本文擬從不同金銀花品種中克隆HQT基因編碼區(qū)序列，通過多重序列比對，揭示金銀花HQT基因變異并按其編碼氨基酸的差異進行分類，再結(jié)合其綠原酸含量的變化，闡明金銀花HQT基因的與綠原酸生物合成的關(guān)系。

1 實驗材料

1.1 植物材料 研究所用的12個忍冬品種(見表1)，分別來自山東、河北、河南等金銀花主要栽培區(qū)。試驗材料均采自山東平邑九間棚公司金銀花種質(zhì)資源收集圃。

表1 金銀花樣品

1.2 試劑 RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen-Sample＆Assay Technologies)，SuperScript?VILOTMcDNA Synthesis Kit、AccuPrimeTMPfx Super Mix(Lifetechologies)，100 bp Plus II DNA Ladder(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，綠原酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，生產(chǎn)批號為11075-200413)。

1.3 儀器 SIGMA 3K-15低溫高速離心機(Sigma);凝膠成像分析儀(BIO-RAD)，DYY-6C電泳儀、水平電泳槽(北京市六一儀器廠)，SANYO－80℃超低溫冰箱、制冰機(SANYO)，GeneAmp9600 PCR儀(Applied Biosystems)，DHG-9053A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司)，KQ-300VDE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，BP211S電子天平(Sartorius)，高效液相色譜儀(Waters)。

2 實驗方法

2.1 總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 采用Qiagen公司的RNA提取試劑盒提取各樣品的總RNA，1.2%瓊脂糖變性膠電泳檢測。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系步驟如下:在微量離心管中配制20 μL混合液，包含模板RNA 2.5 μg，5X VILO［TM］Reaction Mix 4 μL，10X SuperScript?Enzyme Mix 2 μL，DEPC-treated water up to 20 μL。25℃保溫10 min，42 ℃保溫60 min，85 ℃保溫5 min，產(chǎn)物于－20℃保存。

2.2 PCR擴增HQT基因編碼區(qū)序列 根據(jù)金銀花HQT基因編碼區(qū)的 cDNA序列［8］，用 Primer Primer 5.0軟件在cDNA末端設(shè)計引物擴增金銀花HQT基因編碼區(qū)，引物序列如下，上游引物HQT-F:CATGCCATGGCTATGGGAAGTGAAGGAAGTGTGAA;下游引物 HQT-R:TCCCCCGGGTCAGAACTCGTACAAACACTTCTCAAA。PCR 反應(yīng)體系(25 μL):AccuPrime PfxSuper Mix 22.5 μL，F(xiàn)orward and reverse primers(10 μmol)1 μL，Template DNA solution(10 pg – 200 ng)0.5 μL。PCR 反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s，58℃退火30 s，68℃延伸30 s，共進行35個循環(huán)，4℃保存。

2.4 HQT基因編碼區(qū)序列的生物信息學(xué)分析 各樣本的測序結(jié)果用MEGA 5.0軟件分析，并輔以人工校對。利用NCBI的Blast功能進行序列相似相比較，利用MEGA 5.0軟件對HQT基因序列進行聚類進化分析。

2.5 綠原酸含量測定及方法學(xué)驗證

2.5.1 色譜條件 色譜柱為Agilent C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.4% 磷酸(13∶87)，進樣量為5 μL，流速 1 mL/min，柱溫25℃，檢測波長327 nm。

2.5.2 對照品溶液及供試品溶液制備［9］對照品溶液制備:精密稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品2.55 mg，加入50%甲醇配制終濃度為0.051 mg/mL的對照品溶液。供試品溶液制備:精密稱取金銀花樣品粉末0.1 g(過藥典4號篩)，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加50%的甲醇20 mL，超聲(270 W，45 kHz)30 min，放冷后稱定補重，搖勻后過濾，精密量取續(xù)濾液10 mL，置25 mL量瓶中，加50%甲醇定容。

2.5.3 線性試驗 按照2.5.1項下的色譜條件，將2.5.2項下配制的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品分別進樣2，4，6，8，10 μL，記錄峰面積。

2.5.4 樣品含量測定 取不同樣品按供試液制備方法制樣并測定，按外標(biāo)法計算綠原酸的含量。

2.5.5 精密度試驗 取同一份對照品溶液，按照設(shè)定的色譜條件，重復(fù)進樣6次測定。

2.5.6 重復(fù)性試驗 取同批樣品(九豐一號)6份，按供試液制備方法制樣并測定。

2.5.7 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液(九綠一號)，分別在 0，1，2，4，8，12，24 h 時測定含量。

催化燃燒熱空氣脫附法是采用催化燃燒反應(yīng)后的熱氣體（控制溫度）加熱吸附床，脫附出來的有機氣體進入催化燃燒階段凈化處理，從而脫附凈化。催化燃燒脫附法所需催化劑的費用較高，并且具有一定的安全隱患。

2.5.8 回收率試驗 精密稱取已知含量的供試品(九綠一號)6份，分別加入6組不同量的綠原酸對照品，按供試液制備方法制樣并測定，每一水平測定3次。

3 結(jié)果與分析

3.1 HQT基因的測序 從12種金銀花樣品中PCR得到了7條HQT基因cDNA編碼序列，長度約1 300 bp。按樣品編號分別將這12條序列編號為1～12，12條序列一致度為98.3% ～100%。利用NCBI的BLAST進行序列相似性比較，與金銀花HQT基因序列［7］(GenBank accession:GQ847546)相 似 性 大 于98%，確定了獲得的cDNA片段為金銀花HQT基因的cDNA片段。

3.2 HQT基因編碼區(qū)序列的變異分析 對12條HQT基因的編碼區(qū)序列進行分析，變異情況見表2。

表2 金銀花HQT基因編碼序列變異

對表2進行分析，發(fā)現(xiàn)HQT基因序列中主要存在以下2種情況的突變，1)單核苷酸多態(tài)性(SNPs):進行比對的12條HQT基因，其編碼區(qū)共有24處SNPs，如在360 bp處的T-A轉(zhuǎn)換，410 bp處的A-C顛換。2)插入/缺失突變:在1～6 bp的位點上，3號樣本存在ATGGCT 6個堿基的插入，但是未引起移碼突變，開放閱讀框完整，為1 326 bp，比其它序列開放閱讀框長度增加6 bp。

3.3 HQT氨基酸序列多態(tài)性分析 利用MEGA 5.0軟件將12條核酸序列翻譯成對應(yīng)的氨基酸，得到長439～441的HQT蛋白氨基酸序列，變異情況見表3。對表3進行分析，共發(fā)現(xiàn)在4個位點氨基酸發(fā)生了突變，其中3號樣品存在一處由2個氨基酸插入引起的突變，這一突變使得3號樣品的起始密碼子提前，比其他樣品氨基酸序列多了2個氨基酸殘基。

表3 金銀花HQT蛋白的氨基酸序列變異

3.4 綠原酸含量測定與方法學(xué)驗證

3.4.1 線性 以進樣量為縱坐標(biāo)Y，峰面積為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.000 000 3 X+0.013 1，R2=0.999 7。表明綠原酸在0.102 ～0.510 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.4.2 樣品含量 每份樣品重復(fù)測定3次，取平均值，結(jié)果見表4。

表4 樣品綠原酸含量測定結(jié)果

3.4.3 精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、回收率 儀器精密度RSD=0.18%，說明儀器精密度良好。供試品溶液制備方法重現(xiàn)性RSD=1.76%，說明制備方法重現(xiàn)性高。樣品穩(wěn)定性RSD=0.84%，表明供試液中的待測組分在24 h內(nèi)是穩(wěn)定的。平均回收率=100.28%，RSD=0.11%(n=6)，以上驗證結(jié)果說明實驗方法和數(shù)據(jù)科學(xué)有效。

4 討論

目前公認(rèn)的綠原酸合成途徑有3條，其中通過HQT催化咖啡酰-CoA與奎尼酸生成綠原酸［10］的途徑是植物體內(nèi)合成綠原酸的主要途徑，本文在對金銀花HQT基因編碼區(qū)序列進行研究時發(fā)現(xiàn)其具有多態(tài)性。

按照表3中4個位點可將HQT基因的突變分為3個類型:類型Ⅰ，在第137、324位點分別是丙氨酸和纈氨酸;類型Ⅱ(3號樣品)，在第1、2位點分別是甲硫氨酸和丙氨酸;類型Ⅲ(4號樣品)，在第137、324位點分別是天冬氨酸和丙氨酸。結(jié)合表4的結(jié)果分析:類型Ⅱ綠原酸含量為1.20%，是所有實驗樣品中含量最少的;類型Ⅲ綠原酸含量為1.89%，相對大多數(shù)品種其含量也較少;類型Ⅰ中各實驗品種綠原酸含量均大于2%。綜合兩項結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HQT基因變異在一定程度上影響了其表達產(chǎn)物綠原酸的含量，證明了二者之間具有一定的相關(guān)性。

其中4號樣品的眾多突變證實了不同種類忍冬的HQT蛋白在基因水平上存在有明顯的差異;5號樣品為金銀花的變種(紅白忍冬)，其綠原酸含量明顯高于其他二倍體品種。以上兩點從不同層面上證明了忍冬分類的準(zhǔn)確性。

綠原酸含量之所以存在明顯的差異，除了基因變異造成的影響，還可能有多種因素的共同作用:如外部環(huán)境的影響，生長在陽坡的金銀花不同器官中綠原酸的含量均高于陰坡的同類樣品［11］;干旱、低溫以及病害感染，都可促使磷酸戊糖途徑的比重增大，使綠原酸含量增多［12］等。另外，實驗結(jié)果中5號樣品是四倍體，其綠原酸含量約為其他普通二倍體品種的2倍左右。由此可見綠原酸的積累有其復(fù)雜的生理學(xué)機制，還有待進一步的具體研究。

本文對金銀花功能蛋白HQT進行基因編碼區(qū)多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)HQT基因具有豐富的變異，其錯義突變導(dǎo)致了HQT蛋白的改變，進而導(dǎo)致了不同品種的樣品中綠原酸含量產(chǎn)生差異。本文發(fā)現(xiàn)了金銀花HQT基因編碼區(qū)和綠原酸含量及種間分類具有一定的相關(guān)性。為科學(xué)的利用和開發(fā)金銀花資源奠定理論基礎(chǔ)和提供科學(xué)手段，為以后的研究工作提供有價值的參考。

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