王 垚，王玉榮，羅 韻，陳萬(wàn)浩，韓燕峰，梁宗琦

(貴州大學(xué)真菌資源研究所，貴州 貴陽(yáng) 550025)

纖維素酶作為一種重要的酶產(chǎn)品，在造紙行業(yè)、紡織工業(yè)、飼料行業(yè)、食品工業(yè)以及秸稈降解等領(lǐng)域都具有廣闊的應(yīng)用前景。自然界中產(chǎn)纖維素酶的生物有很多，細(xì)菌、放線菌、真菌和昆蟲(chóng)等都能產(chǎn)生;而目前研究最多是絲狀真菌，因?yàn)樗鼈兙哂挟a(chǎn)酶效率高、便于提取、產(chǎn)酶比例適當(dāng)?shù)葍?yōu)點(diǎn)［1］。這些產(chǎn)酶真菌又以木霉屬 Trichoderma Pers.、曲霉屬Aspergillus Link和青霉屬 Penicillium Link報(bào)道最多;但它們大多存在酶系組分不全、活性不穩(wěn)定、作用pH范圍窄、特別是產(chǎn)酶溫度要求高等問(wèn)題［2］，大大限制了它們的應(yīng)用。低溫纖維素酶在自然條件(特別是低溫的自然條件)下仍可以高效發(fā)揮作用，與中高溫酶相比在應(yīng)用上更具優(yōu)勢(shì)和潛力［3］。從自然界擴(kuò)大產(chǎn)纖維素酶真菌篩選，獲得應(yīng)用范圍廣的菌株，現(xiàn)已受到人們更多的關(guān)注［4-5］。

隨著城市化水平和人民生活水平的不斷提高，城市生活垃圾產(chǎn)出量與日俱增，由此引發(fā)的環(huán)境問(wèn)題也日益突出。我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，城市生活垃圾采用堆肥技術(shù)，既符合國(guó)情，又能達(dá)到垃圾無(wú)害化、減量化、資源化的目的，前景相當(dāng)廣闊［6］。研究中的大量資料表明［7］，纖維素分解作用是堆肥腐熟的關(guān)鍵問(wèn)題，但天然纖維素分解菌的活性低，降解速度慢;再加上我國(guó)北方地區(qū)平均氣溫較低，纖維素降解更受限制。這就需要對(duì)產(chǎn)纖維素酶的微生物進(jìn)行大量篩選，從而獲得在自然條件(特別是低溫的自然條件)下仍能產(chǎn)生高活性纖維素酶的菌株，以提高堆肥腐熟的效率。

帚霉屬 Scopulariopsis是 Bainier于 1907年建立的，其模式種為 S.brevicaulis(Sacc.)Bainier。后來(lái)，Manual(1949)指出其產(chǎn)孢細(xì)胞為具有環(huán)痕的瓶梗，而Hughes(1953)對(duì)該產(chǎn)孢細(xì)胞進(jìn)行了更詳細(xì)的描述:“產(chǎn)孢細(xì)胞隨著孢子的產(chǎn)生而延長(zhǎng)，每次都留下一個(gè)疤痕，這種產(chǎn)孢細(xì)胞稱為環(huán)痕梗。”至此，該屬的概念才明確。現(xiàn)已知該屬的有性階段為小囊菌屬 Microascu Zukal［8］。帚霉屬分布廣泛，植物種籽、纖維物質(zhì)、糞、土壤、空氣等都可帶菌，還能參與纖維素、糞素的分解和腐殖質(zhì)的形成［9］。所以帚霉也是產(chǎn)纖維素酶的潛在菌種資源。

作者于2013年在進(jìn)行中國(guó)部分地區(qū)戴氏霉屬Taifanglania Liang et al.真菌資源調(diào)查及其對(duì)木質(zhì)纖維素的降解研究時(shí)，從陜西合陽(yáng)縣蔥的根際土壤中分離到一株真菌E71702M，經(jīng)形態(tài)學(xué)結(jié)合分子系統(tǒng)學(xué)手段鑒定為草生帚霉Scopulariopsis hibernica Mangan。在國(guó)內(nèi)，此菌僅見(jiàn)有名錄，而無(wú)詳細(xì)描述記載［10］。經(jīng)初步試驗(yàn)表明，草生帚霉 S.hibernica E71702M菌株，在較低溫度(10℃)條件下亦具有明顯的纖維素酶活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 采集自我國(guó)陜西合陽(yáng)縣蔥的根際土壤。菌株保存于貴州大學(xué)真菌資源研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基 馬丁氏培養(yǎng)基:磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，瓊脂18 g，孟加拉紅1/300 mL。用前待溫度冷卻在40℃ 左右，加入青霉素 20 pg/mg，鏈霉素 40 pg/mg，水1 000 mL，pH自然。滅菌條件:121℃ 滅菌30 min。(以下滅菌條件與此相同)。

PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g切塊，用水煮沸30 min，加葡萄糖 20 g，瓊脂 20 g，水補(bǔ)足 1 000 mL，pH自然。

CMC剛果紅培養(yǎng)基:羧甲基纖維素鈉2 g，硫酸銨2 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸氫二鉀1 g，氯化鈉0.5 g，剛果紅0.4 g瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，明膠2 g，pH值自然。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化 分離菌株參照文獻(xiàn)［11］的方法，稱取2 g樣品加入盛有20 mL無(wú)菌水和玻璃珠的三角瓶中，振蕩10 min左右，使土樣均勻地分散在無(wú)菌水中成為懸液，靜置片刻，然后吸取1 mL懸液到含9 mL無(wú)菌水的試管中并充分混勻，依次按10倍法稀釋，稀釋到10-1～10-3倍。吸取1 mL稀釋后的懸液于干凈無(wú)菌的平板上，倒入20 mL左右添加了雙抗(鏈霉素和青霉素)的馬丁氏培養(yǎng)基，待冷卻后置于25℃ 培養(yǎng)。培養(yǎng)5 d后，在顯微鏡下進(jìn)行觀察并分離純化，純化后轉(zhuǎn)移至PDA斜面保存。

1.2.2 形態(tài)鑒定 參照 Bainier［12］和 Morton等人［13］的方法，將菌株 E71702M 接種于 PDA培養(yǎng)基上25℃ 培養(yǎng)，觀察記錄菌落的大小、質(zhì)地、顏色、邊緣情況等。采用膠帶粘片法制片，在 Motic數(shù)碼顯微鏡下觀察產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)特征，記錄其菌絲、分生孢子梗、產(chǎn)孢細(xì)胞形狀大小和分生孢子的形態(tài)大小等特征，并選取具典型性狀特征的視野拍照。

1.2.3 DNA序列提取和PCR擴(kuò)增 刮取平板上生長(zhǎng)旺盛的菌絲和孢子，經(jīng)DNA提取后，采用通用引物ITS4 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'和ITS5 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

擴(kuò)增體系選用25 μL反應(yīng)體系，包括引物ITS4 1 μL，ITS5 1 L，2 × Master Mix 12.5 μL，模板 2 μL，用無(wú)菌ddH2O補(bǔ)足25 μL。PCR條件為:94℃ 預(yù)變性3 min;94℃ 變性30 s，55℃ 退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物送北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行測(cè)序，得到的序列經(jīng)校正后提交 GenBank(KJ704846)。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建 在 Gen-Bank上經(jīng)Blast后，下載與E71702M菌株序列相似性 ＞80% 的菌株序列共19條，以菌株Scedosporium apiospermum 532F08的ITS1-5.8S-ITS2 rDNA序列為外群，在CLUSTAL X1.83上進(jìn)行序列比對(duì)，手工校正后，用 Mega5.0中的鄰接法 (NJ)，經(jīng)1 000次 bootstrap驗(yàn)證，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)［14］。

1.2.5 產(chǎn)纖維素酶測(cè)定 參照文獻(xiàn)［15］的方法，取平板上生長(zhǎng)旺盛的菌絲和孢子，點(diǎn)接種于 CMC剛果紅平板中，分別置于10℃、17℃、25℃、32℃、40℃ 下恒溫培養(yǎng)。每個(gè)溫度3個(gè)重復(fù)。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)鑒定

PDA培養(yǎng)基上，25℃，7 d菌落直徑12～14 mm，6周長(zhǎng)滿整個(gè)平板。菌落平展，中部稍有隆起，近粉狀，橄欖黑色，易發(fā)生角變現(xiàn)象;背面邊緣一輪白色，其余黑色。菌絲透明或半透明，無(wú)色或淡褐色，光滑，1.5～3 μm。瓶梗3.5 ～20 μm ×1.5 ～3 μm，常單生于氣生菌絲上，或在?；锨嗝?fàn)钆帕校h(huán)痕區(qū)長(zhǎng)1～2 μm。?；@著膨大，6 ～8.5 μm ×2 ～5 μm。分生孢子幼時(shí)光滑，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生疣突，倒卵形、橢圓形至短棒狀，4.5～6 μm×2.5 ～4 μm，聚集成長(zhǎng)鏈(圖1)。

圖1 草生帚霉S.hibernica E71702M的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和菌落特征Fig.1 Conidiogenous structures and colony characteristics of S.hibernica E71702M

草生帚霉Scopulariopsis hibernica Mangan的主要鑒別特征是［16］:梗基顯著膨大，瓶梗3.5～22.5 μm，分生孢子倒卵形至短棒狀。該種與球孢帚霉S.sphaerospora Zach，雪白帚霉 S.nivea Demelius和黑帚霉S.carbonaria Morton＆Smith相似。球孢帚霉和雪白帚霉的分生孢子均為球形，與草生帚霉分生孢子倒卵形至短棒狀易于區(qū)分。黑帚霉分生孢子卵形，瓶梗 4～8μm，與該種也可明顯區(qū)分。E71702M菌株除作者在后期可觀察到分生孢子具疣突外，同該種形態(tài)描述基本一致。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示(圖2)，這些序列分為2個(gè)進(jìn)化分支。進(jìn)化分支Ⅰ包含兩個(gè)屬:帚霉屬Scopulariopsis Bainier和它的有性階段——小囊菌屬M(fèi)icroascus Zukal，它們以100% 的支持率聚在一起。作者觀察研究的菌株 E71702M與S.hibernica的兩個(gè)菌株以100% 的支持率聚在一個(gè)獨(dú)立的亞分支中，說(shuō)明它們的關(guān)系非常近。進(jìn)化分支Ⅱ包含毛束霉屬Trichurus Clem，矛束霉屬Doratomyces Corda和沃德霉屬 Wardomyces Brooks＆Hansford三個(gè)屬中的一些種。

結(jié)合E71702M的形態(tài)學(xué)特征和分子系統(tǒng)學(xué)分析提供的信息，菌株 E71702M被鑒定為草生帚霉Scopulariopsis hibernica Mangan。

圖2 E71702M菌株和相關(guān)種基于ITS-5.8Sr DNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on the ITS-5.8SrDNA sequences of E71702M and its relatives

2.3 產(chǎn)纖維素酶測(cè)定

CMC剛果紅平板顯示(圖3)，菌株E71702M在10℃、17℃、25℃ 和32℃ 的溫度下均見(jiàn)有纖維素酶活性，而在40℃ 下未見(jiàn)有纖維素酶活性，這很可能是菌株E71702M無(wú)法適應(yīng)高溫環(huán)境的緣故。

圖3 E71702M菌株在不同溫度下產(chǎn)纖維素酶情況Fig.3 Cellulase hydrolysis of strain E71702M at different temperatures

對(duì)菌株E71702M在不同溫度條件下產(chǎn)生的纖維素水解圈的直徑進(jìn)行方差分析，32℃產(chǎn)生的水解圈直徑最大，它與其他溫度的差異均達(dá)到顯著水平;17℃ 次之，10℃ 再次之，但二者差異并不顯著(P=0.086＞0.05);菌株 E71702M 在25℃ 時(shí)產(chǎn)生的纖維素水解圈最小。

某種程度上纖維素水解圈的大小，代表了菌株產(chǎn)纖維素酶能力的強(qiáng)弱。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3和表1)表明，菌株E71702M在32℃ 時(shí)產(chǎn)酶能力最強(qiáng)，其次是17℃ 和10℃;在25℃ 下生長(zhǎng)情況最好。值得注意的是，菌株E71702M在較低溫度(10℃)下產(chǎn)生的纖維素水解圈直徑不僅與17℃ 時(shí)沒(méi)有明顯差異，而且同32℃ 時(shí)產(chǎn)生的最大水解圈相比也只相差15%，說(shuō)明此菌株具有在低溫條件下產(chǎn)纖維素酶的潛力。

表1 不同溫度條件下纖維素水解圈直徑Tab.1 The diameters of cellulase hydrolysis zone at different temperatures

3 討論

目前，草生帚霉S.hibernica除耿月華等在《藏東三江峽谷地帶土壤暗色絲孢菌研究初報(bào)》中提及菌名外［10］，該種在國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)詳細(xì)的描述報(bào)道。此外，有關(guān)該種產(chǎn)纖維素酶以及其它的應(yīng)用研究，國(guó)內(nèi)外也未見(jiàn)報(bào)道。本文對(duì)該種不僅進(jìn)行了詳細(xì)的特征描述和分子鑒定，還對(duì)它的產(chǎn)纖維素酶能力進(jìn)行了初步研究。

在進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)進(jìn)化分支Ⅱ的3個(gè)屬，沃德霉屬 Wardomyces是小囊菌屬的無(wú)性型［17］;矛束霉屬 Doratomyces與帚霉屬具有相同的產(chǎn)孢方式，2個(gè)屬界限模糊，因而有人認(rèn)為矛束霉屬不過(guò)是帚霉屬的孢梗束時(shí)期，應(yīng)該把它們劃分在1個(gè)屬內(nèi)［18］;毛束霉屬 Trichurus與頭束霉 Cephalotrichum Link聯(lián)系緊密［19］。小囊菌屬的無(wú)性型還有頭束霉 Cephalotrichum［17］，所以進(jìn)化分支Ⅱ的3個(gè)屬與帚霉屬的親緣關(guān)系也較密切，這從整個(gè)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系支持了菌株E71702M鑒定為S.hibernica的合理性。

菌株E71702M在25℃ 下生長(zhǎng)情況最好，是典型的中溫微生物，但具有在較低溫度下(10℃)產(chǎn)纖維素酶的潛力。低溫酶并非只來(lái)自低溫微生物，有報(bào)道從腐殖質(zhì)土樣中分離得到的1株中溫纖維弧菌，在0℃ 時(shí)的殘留酶活力仍為最大酶活的60%，屬于典型的低溫酶［3］。

秸稈中含有大量的纖維素，在高溫堆腐條件下，較易腐解。而秸稈的應(yīng)用難題在于農(nóng)田秸稈大規(guī)模的降解，其腐解溫度低，需要篩選常溫或低溫條件下能夠產(chǎn)生高活性的纖維素酶菌株加快秸稈腐熟［2］。目前報(bào)道的產(chǎn)纖維素酶菌株對(duì)其產(chǎn)酶溫度的研究大多都在25℃ 以上［20-21］，不利于在田間低溫條件下發(fā)揮作用，為此，低溫纖維素酶的研究已成為國(guó)內(nèi)研究的熱點(diǎn)［5］。此外，冬季城市垃圾的處理也急需尋找低溫產(chǎn)纖維素酶的菌種。本文報(bào)道的菌株E71702M 在10℃、17℃、25℃ 和32℃ 的溫度下均有纖維素酶活性，是1株值得關(guān)注的具有產(chǎn)生低溫纖維素酶潛力的菌株。

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