趙 醒，趙宇陽，王 軍，趙 楊，劉莎莎，劉海旺，程 玉，李春輝

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德067000)

食管癌是人類常見的惡性腫瘤，在消化道腫瘤中僅次于胃癌而居第2位。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，任何腫瘤的發(fā)生都與正常細(xì)胞的調(diào)控周期失調(diào)有關(guān)。CyclinD1是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子之一［1］，是G1期細(xì)胞周期素，可能與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。本研究觀察了CyclinD1在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平，并探討其意義，旨在為臨床提供一定的參考依據(jù)。

臨床資料:選擇2007年1月～2010年12月承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院食管鱗狀細(xì)胞癌患者70例，病理檢查確診，術(shù)前患者均未經(jīng)任何化療及放療治療。其中男38例、女32例，年齡38～80歲，其中≤60歲41例，＞60歲29例;腫瘤直徑＜3 cm者15例，≥3 cm者55例;黏膜內(nèi)癌6例，侵及肌層23例，侵及纖維膜及周圍軟組織41例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移54例;高中分化43例，低分化27例。手術(shù)切除腫瘤組織全部標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，普通石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。另選取上述病例中18例患者，高分化、中分化、低分化鱗狀細(xì)胞癌各6例，標(biāo)本獲取后置于液氮罐中，轉(zhuǎn)移到-80℃的低溫冰箱中保存待檢。

CyclinD1蛋白檢測(cè)方法:采用SP免疫組化染色，具體步驟按照試劑盒說明書(SP試劑盒、DAB顯色劑均購(gòu)自福建邁新技術(shù)有限公司)進(jìn)行，染色時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照(以PBS代替Ⅰ抗)。CyclinD1以細(xì)胞核出現(xiàn)背景清晰的棕黃或棕褐色顆粒為陽性。陽性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞0～5%計(jì)為0分，6%～20%計(jì)為1分，21%～50%計(jì)為2分，50%以上計(jì)為3分。0、1分視為陰性，2、3分視為陽性。采用Western blotting法，取-80℃保存的新鮮食管癌組織提取總蛋白，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。每孔上樣量為30 μg，電泳、轉(zhuǎn)膜，含5%脫脂奶粉封閉液中封閉;在裝有稀釋好的一抗工作液的雜交袋中過夜，PBS洗膜3次，每次15 min;加二抗于室溫孵育2 h后曝光，觀察結(jié)果。

結(jié)果:低分化食管鱗狀細(xì)胞癌中CyclinD1蛋白表達(dá)較高中分化高(P＜0.05)，詳見表1。6例高分化食管鱗狀細(xì)胞癌，6例中分化食管鱗狀細(xì)胞癌，6例低分化食管鱗狀細(xì)胞癌患者食管組織中CyclinD1相對(duì)表達(dá)量分別為 0.184 ±0.014、0.624 ±0.055、0.952 ±0.087，兩兩比較，P 均 ＜0.05。見圖1。

表1 食管鱗狀細(xì)胞癌中CyclinD1蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

圖1 CyclinD1蛋白在不同分化程度食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)

討論:我國(guó)是食管癌病死率最高的國(guó)家，很多研究證明，飲食及遺傳因素在食管癌的發(fā)生和發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用，例如亞硝胺、辛辣食物等，但具體病因尚不清楚。腫瘤是由于正常細(xì)胞在基因水平上失去對(duì)其生長(zhǎng)的正常調(diào)控，異常增殖而形成的新生物。任何細(xì)胞的增殖都是通過細(xì)胞周期來完成的，所以細(xì)胞周期的調(diào)控機(jī)制得到了醫(yī)學(xué)界的關(guān)注。CyclinD1在各種周期蛋白中的意義最大，其作用在于促進(jìn)細(xì)胞周期G1/S的轉(zhuǎn)換，屬于正性調(diào)控因子，其基因編碼定位于人染色體11q13，長(zhǎng)約15 kb，有5個(gè)外顯子，4個(gè)內(nèi)含子，編碼295個(gè)氨基酸及相對(duì)分子質(zhì)量為34 kD的蛋白［2］。

研究［3～6］表明，CyclinD1 在多種惡性腫瘤中都有過表達(dá)現(xiàn)象，包括頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、食管癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等。證明CyclinD1在腫瘤形成過程中是以癌基因的作用出現(xiàn)的，本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化方法，初步檢測(cè)了CyclinD1在不同病理參數(shù)鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)程度，雖然該蛋白只在不同組織學(xué)分級(jí)表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在其他參數(shù)中我們也發(fā)現(xiàn)惡性程度越高，該蛋白的表達(dá)量越高。我們根據(jù)免疫組化結(jié)果進(jìn)一步進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，結(jié)果顯示，高、中、低分化中CyclinD1蛋白表達(dá)兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與相關(guān)研究［7，8］結(jié)果一致。CyclinD1在多種腫瘤［9～11］中都被證明是反映預(yù)后的重要指標(biāo)，在食管癌中也有相關(guān)報(bào)道［12，13］。本研究中免疫組化方法存在一定的主觀性，且兩種檢測(cè)方法都是在蛋白水平上的檢測(cè)，下一階段我們將在分子水平上探討CyclinD1蛋白與食管癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系。

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