文/屈森虎 楊 磊 陳 媛

前言

木質(zhì)素的資源十分豐富，是植物光合作用制造的總量?jī)H次于纖維素的有機(jī)化合物，估計(jì)全球的木質(zhì)素年產(chǎn)量可達(dá)到1500億噸。然而，木質(zhì)素資源并沒有得到有效的利用，大量的木質(zhì)素作為造紙工業(yè)的副產(chǎn)物而排放，不僅是資源的一大浪費(fèi)，而且嚴(yán)重污染環(huán)境。采用物理和化學(xué)處理法，可減少約50% 的木質(zhì)素排放，但治理成本高，易造成二次污染。利用生物技術(shù)降解木質(zhì)素，可以減少環(huán)境污染，變廢為寶，實(shí)現(xiàn)資源再利用。因此，認(rèn)識(shí)木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和了解其生物降解的研究進(jìn)展，對(duì)于木質(zhì)素資源的合理化利用將具有一定的指導(dǎo)意義。

概況

木質(zhì)素（lignin）是由四種醇單體（對(duì)香豆醇、松柏醇、5-羥基松柏醇、芥子醇）形成的一種復(fù)雜酚類聚合物。木質(zhì)素是構(gòu)成植物細(xì)胞壁的成分之一，具有使細(xì)胞相連的作用。在植物組織中具有增強(qiáng)細(xì)胞壁及黏合纖維的作用。其組成與性質(zhì)比較復(fù)雜，并具有極強(qiáng)的活性。不能被動(dòng)物所消化，在土壤中能轉(zhuǎn)化成腐殖質(zhì)。如果簡(jiǎn)單定義木質(zhì)素的話，可以認(rèn)為木質(zhì)素是對(duì)羥基肉桂醇類的酶脫氫聚合物。

實(shí)驗(yàn)步驟

兩種不同來源：木質(zhì)素黑液、經(jīng)木質(zhì)素黑液馴化4個(gè)月后的土壤。

LB培養(yǎng)基：酵母浸膏5.0g、蛋白胨10.0g、氯化鈉5.0g、瓊脂19.0g、蒸餾水1000ml。

方法：（1）木質(zhì)素黑液的配制：稱取11.0125g粗木質(zhì)素，加水定容至1000ml，作梯度稀釋10-1、10-2、10-3。每個(gè)梯度做3個(gè)樣。（2）制作平板。LB-培養(yǎng)基：培養(yǎng)皿編號(hào)后，將已融化并冷卻至50℃左右的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中。RB-LB培養(yǎng)基：將滅菌后一定體積濃度為5mg/ml 的RB亮藍(lán)溶液與滅菌后冷卻到60℃左右的LB培養(yǎng)基混勻（圖1所示）。（3）將木質(zhì)素黑液接到RB-LB平板上，分別進(jìn)行梯度稀釋10-1、10-2、10-3 、10-4、10-5 。取5個(gè)樣，每個(gè)樣品制作2個(gè)平行樣品，一共10個(gè)樣品。再從RB-LB培養(yǎng)基上挑出有顏色變化的菌落接到LB培養(yǎng)基的平板上，進(jìn)行分離提純，篩出來純種菌落。（圖2所示）

細(xì)菌的木質(zhì)素降解率的測(cè)定

培養(yǎng)基：無機(jī)鹽培養(yǎng)基 L-MSM。

磷酸氫二鈉2.4g、磷酸氫二鉀2.0g、硝酸銨0.1g、硫酸鎂0.01g、氯化鈣0.01g、葡萄糖10g、蛋白胨5g、trace element solution 1ml、Kraft Lignin500mg、蒸餾水1000ml、PH 7.6 。

方法：在250ml錐形瓶中加入約100ml的L-MSM液體培養(yǎng)基，接入經(jīng)過一夜液體培養(yǎng)的菌液1ml，一共做3個(gè)平行的錐形瓶，不接入的L-MSM培養(yǎng)基作為空白組，然后放入搖床培養(yǎng)（120rpm，30℃）。連續(xù)培養(yǎng)十四天，每天定期取樣測(cè)定降解率，分別取空白組和實(shí)驗(yàn)組各30ml，在8000r/min的條件下，離心15min，去取上清液并用HCl酸化至PH1-2，然后去離心（8000r/min，離心30min），從而得到酸沉物，拿去烘干（60-65℃，條件下烘48h），最后稱重。（其中假定空白組最后烘干得到的重量為100%）。

計(jì)算結(jié)果

FPA酶活力按下式計(jì)算：

X1=A×1/0.5×n

式中：

X1—樣品的濾紙酶活力（FPA），u/g（或u/ml）；A—根據(jù)吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查的（或計(jì)算出）的還原糖量，m g；1/0.5—換算成酶液1ml；n—酶樣的稀釋倍數(shù)。

圖1 RB-LB培養(yǎng)基

圖2 篩選后的純種菌落

結(jié)語

本文的主要內(nèi)容是進(jìn)行木質(zhì)素降解細(xì)菌的分離與生化特性研究，從細(xì)菌的篩選與提純、測(cè)定細(xì)菌的木質(zhì)素降解率、酶活等實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了分析與研究，得出了以下結(jié)論。

（1）篩菌結(jié)果：細(xì)菌的來源分別為木質(zhì)素黑液與經(jīng)木質(zhì)素黑液馴化4個(gè)月后的土壤，通過接菌、梯度稀釋進(jìn)行分離提純，篩出來純種菌落，得到13個(gè)細(xì)菌。（2）細(xì)菌的木質(zhì)素降解率：將經(jīng)過一夜培養(yǎng)的菌液加入到無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，并加一個(gè)空白做對(duì)照，由測(cè)得的質(zhì)量計(jì)算得出每天的降解率。通過對(duì)13種細(xì)菌進(jìn)行數(shù)據(jù)對(duì)比，可以看出1、4、10、11、12、13號(hào)菌的木質(zhì)素降解率比較高，說明它們的降解效果較其他細(xì)菌更明顯。（3）細(xì)菌的纖維素酶活：纖維素酶是指在各種酶組分的協(xié)同作用下，能降解纖維素酶、使之變成纖維寡糖、纖維二糖和葡萄糖的酶。測(cè)定酶活采用的是纖維素酶制劑QB2583-2003，培養(yǎng)基為產(chǎn)酶培養(yǎng)基，分別測(cè)第二、第四、第六、第八、第十天酶活。酶活高說明其還原糖含量高，從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可分析得出1、2、3、4、11、12號(hào)這五種菌的酶活較優(yōu)秀。（4）細(xì)菌的微生物鑒定：根據(jù)細(xì)菌的木質(zhì)素降解率與酶活數(shù)據(jù)挑選出1、4、11號(hào)三種菌進(jìn)行微生物鑒定，結(jié)果為：1號(hào)菌是無色桿菌、4號(hào)菌是木糖氧化無色桿菌、11號(hào)菌是溶血性葡萄球菌。（5）生物強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果：測(cè)定COD采用的是參見國(guó)標(biāo)GB11914-89。結(jié)果從曲線圖可以明顯看出1、11號(hào)細(xì)菌第七天測(cè)的COD比不加菌的都高，而4號(hào)菌比其他三個(gè)都小很多。因此，單從數(shù)據(jù)上比較，4號(hào)菌的優(yōu)勢(shì)相對(duì)大一些，說明4號(hào)菌的降解能力較為優(yōu)秀。測(cè)定色度采用的是GB11903-89，把13種細(xì)菌接入用秸稈粉末作為碳源的培養(yǎng)基，經(jīng)過十天錐形瓶?jī)?nèi)顏色有明顯差異，其中3、4、7、8、11、12這幾種細(xì)菌接入培養(yǎng)基后顏色比其它菌要淡很多。說明這幾種細(xì)菌對(duì)于木質(zhì)素降解是有效果的。

綜上所述，4號(hào)菌木糖氧化無色桿菌降解能力最為優(yōu)秀。