文/屈森虎 楊 磊 陳 媛
木質(zhì)素的資源十分豐富,是植物光合作用制造的總量?jī)H次于纖維素的有機(jī)化合物,估計(jì)全球的木質(zhì)素年產(chǎn)量可達(dá)到1500億噸。然而,木質(zhì)素資源并沒有得到有效的利用,大量的木質(zhì)素作為造紙工業(yè)的副產(chǎn)物而排放,不僅是資源的一大浪費(fèi),而且嚴(yán)重污染環(huán)境。采用物理和化學(xué)處理法,可減少約50% 的木質(zhì)素排放,但治理成本高,易造成二次污染。利用生物技術(shù)降解木質(zhì)素,可以減少環(huán)境污染,變廢為寶,實(shí)現(xiàn)資源再利用。因此,認(rèn)識(shí)木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和了解其生物降解的研究進(jìn)展,對(duì)于木質(zhì)素資源的合理化利用將具有一定的指導(dǎo)意義。
木質(zhì)素(lignin)是由四種醇單體(對(duì)香豆醇、松柏醇、5-羥基松柏醇、芥子醇)形成的一種復(fù)雜酚類聚合物。木質(zhì)素是構(gòu)成植物細(xì)胞壁的成分之一,具有使細(xì)胞相連的作用。在植物組織中具有增強(qiáng)細(xì)胞壁及黏合纖維的作用。其組成與性質(zhì)比較復(fù)雜,并具有極強(qiáng)的活性。不能被動(dòng)物所消化,在土壤中能轉(zhuǎn)化成腐殖質(zhì)。如果簡(jiǎn)單定義木質(zhì)素的話,可以認(rèn)為木質(zhì)素是對(duì)羥基肉桂醇類的酶脫氫聚合物。
兩種不同來源:木質(zhì)素黑液、經(jīng)木質(zhì)素黑液馴化4個(gè)月后的土壤。
LB培養(yǎng)基:酵母浸膏5.0g、蛋白胨10.0g、氯化鈉5.0g、瓊脂19.0g、蒸餾水1000ml。
方法:(1)木質(zhì)素黑液的配制:稱取11.0125g粗木質(zhì)素,加水定容至1000ml,作梯度稀釋10-1、10-2、10-3。每個(gè)梯度做3個(gè)樣。(2)制作平板。LB-培養(yǎng)基:培養(yǎng)皿編號(hào)后,將已融化并冷卻至50℃左右的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中。RB-LB培養(yǎng)基:將滅菌后一定體積濃度為5mg/ml 的RB亮藍(lán)溶液與滅菌后冷卻到60℃左右的LB培養(yǎng)基混勻(圖1所示)。(3)將木質(zhì)素黑液接到RB-LB平板上,分別進(jìn)行梯度稀釋10-1、10-2、10-3 、10-4、10-5 。取5個(gè)樣,每個(gè)樣品制作2個(gè)平行樣品,一共10個(gè)樣品。再從RB-LB培養(yǎng)基上挑出有顏色變化的菌落接到LB培養(yǎng)基的平板上,進(jìn)行分離提純,篩出來純種菌落。(圖2所示)
培養(yǎng)基:無機(jī)鹽培養(yǎng)基 L-MSM。
磷酸氫二鈉2.4g、磷酸氫二鉀2.0g、硝酸銨0.1g、硫酸鎂0.01g、氯化鈣0.01g、葡萄糖10g、蛋白胨5g、trace element solution 1ml、Kraft Lignin500mg、蒸餾水1000ml、PH 7.6 。
方法:在250ml錐形瓶中加入約100ml的L-MSM液體培養(yǎng)基,接入經(jīng)過一夜液體培養(yǎng)的菌液1ml,一共做3個(gè)平行的錐形瓶,不接入的L-MSM培養(yǎng)基作為空白組,然后放入搖床培養(yǎng)(120rpm,30℃)。連續(xù)培養(yǎng)十四天,每天定期取樣測(cè)定降解率,分別取空白組和實(shí)驗(yàn)組各30ml,在8000r/min的條件下,離心15min,去取上清液并用HCl酸化至PH1-2,然后去離心(8000r/min,離心30min),從而得到酸沉物,拿去烘干(60-65℃,條件下烘48h),最后稱重。(其中假定空白組最后烘干得到的重量為100%)。
FPA酶活力按下式計(jì)算:
X1=A×1/0.5×n
式中:
X1—樣品的濾紙酶活力(FPA),u/g(或u/ml);A—根據(jù)吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查的(或計(jì)算出)的還原糖量,m g;1/0.5—換算成酶液1ml;n—酶樣的稀釋倍數(shù)。
圖1 RB-LB培養(yǎng)基
圖2 篩選后的純種菌落
本文的主要內(nèi)容是進(jìn)行木質(zhì)素降解細(xì)菌的分離與生化特性研究,從細(xì)菌的篩選與提純、測(cè)定細(xì)菌的木質(zhì)素降解率、酶活等實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了分析與研究,得出了以下結(jié)論。
(1)篩菌結(jié)果:細(xì)菌的來源分別為木質(zhì)素黑液與經(jīng)木質(zhì)素黑液馴化4個(gè)月后的土壤,通過接菌、梯度稀釋進(jìn)行分離提純,篩出來純種菌落,得到13個(gè)細(xì)菌。(2)細(xì)菌的木質(zhì)素降解率:將經(jīng)過一夜培養(yǎng)的菌液加入到無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,并加一個(gè)空白做對(duì)照,由測(cè)得的質(zhì)量計(jì)算得出每天的降解率。通過對(duì)13種細(xì)菌進(jìn)行數(shù)據(jù)對(duì)比,可以看出1、4、10、11、12、13號(hào)菌的木質(zhì)素降解率比較高,說明它們的降解效果較其他細(xì)菌更明顯。(3)細(xì)菌的纖維素酶活:纖維素酶是指在各種酶組分的協(xié)同作用下,能降解纖維素酶、使之變成纖維寡糖、纖維二糖和葡萄糖的酶。測(cè)定酶活采用的是纖維素酶制劑QB2583-2003,培養(yǎng)基為產(chǎn)酶培養(yǎng)基,分別測(cè)第二、第四、第六、第八、第十天酶活。酶活高說明其還原糖含量高,從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可分析得出1、2、3、4、11、12號(hào)這五種菌的酶活較優(yōu)秀。(4)細(xì)菌的微生物鑒定:根據(jù)細(xì)菌的木質(zhì)素降解率與酶活數(shù)據(jù)挑選出1、4、11號(hào)三種菌進(jìn)行微生物鑒定,結(jié)果為:1號(hào)菌是無色桿菌、4號(hào)菌是木糖氧化無色桿菌、11號(hào)菌是溶血性葡萄球菌。(5)生物強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果:測(cè)定COD采用的是參見國(guó)標(biāo)GB11914-89。結(jié)果從曲線圖可以明顯看出1、11號(hào)細(xì)菌第七天測(cè)的COD比不加菌的都高,而4號(hào)菌比其他三個(gè)都小很多。因此,單從數(shù)據(jù)上比較,4號(hào)菌的優(yōu)勢(shì)相對(duì)大一些,說明4號(hào)菌的降解能力較為優(yōu)秀。測(cè)定色度采用的是GB11903-89,把13種細(xì)菌接入用秸稈粉末作為碳源的培養(yǎng)基,經(jīng)過十天錐形瓶?jī)?nèi)顏色有明顯差異,其中3、4、7、8、11、12這幾種細(xì)菌接入培養(yǎng)基后顏色比其它菌要淡很多。說明這幾種細(xì)菌對(duì)于木質(zhì)素降解是有效果的。
綜上所述,4號(hào)菌木糖氧化無色桿菌降解能力最為優(yōu)秀。