王 麗，劉 飛，桑宏慶

（安徽科技學院 食品藥品學院，安徽 鳳陽 233100）

久效磷，分子式為C7H14NO5P，學名O，O－二甲基－O－（1－甲基－2－甲基氨基甲?；┮蚁┗姿狨?，相對分子量為223.16，為乙烯型磷酸酯類殺蟲劑，兼具內(nèi)吸與觸殺作用，殺蟲譜廣，速效性好，殘存期長，對魚類及水生動物有毒，對鳥類和蜜蜂高毒，屬于高毒農(nóng)藥［1］。核酸適體（Aptamer）是一種新型的仿生生物識別元素，是通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術從人工體外合成的隨機寡核苷酸庫中反復篩選得到的能與靶分子特異性結合的單鏈的DNA或RNA［2－3］。如果能成功篩選久效磷的核酸適體，將為久效磷的檢測開拓新的思路。核酸適體篩選的首要步驟是寡核苷酸庫的構建，堿基是寡核苷酸的重要組成，從微觀入手研究堿基和久效磷的作用，將為核酸適體庫的構建及適體的篩選奠定基礎。

紫外可見吸收光譜是研究小分子與堿基和DNA相互作用的一種最簡便、最常用的技術，小分子與堿基的相互作用會引起特征吸收峰的紅移或藍移現(xiàn)象及增色和減色現(xiàn)象，因此通過吸收峰的變化可以判斷堿基和小分子的作用程度［4－5］。童裳倫等［6］通過紫外可見吸收光譜法研究發(fā)現(xiàn)百草枯分子通過嵌插方式結合到小牛胸腺DNA的雙螺旋結構上。何盈盈等［7］研究發(fā)現(xiàn)蒽與DNA堿基胸腺嘧啶以面對面相平行的方式發(fā)生了P－P電子給體受體作用。胡興等［8］研究發(fā)現(xiàn)金屬離子對DNA－抗蚜威結合的影響程度主要取決于金屬離子與DNA堿基和磷酸基團間結合的相對親和比。張玥等［9］利用紫外光譜法研究了利谷隆與DNA的相互作用，推斷利谷隆與DNA可能發(fā)生嵌插作用。王麗等［10］曾通過紫外吸收光譜法研究甲拌磷、丙溴磷、水胺硫磷、氧化樂果與四種堿基的相互作用，推斷了有機磷農(nóng)藥與核酸適體作用的活性位點。本文利用紫外吸收光譜法研究了不同pH值以及Na+、K+和Mg2+濃度條件下，四種堿基對久效磷紫外吸收光譜的影響，旨在了解久效磷與四種堿基的作用程度，為久效磷適體篩選過程中適體庫恒定區(qū)域的設計和緩沖體系的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

UV－1800紫外可見分光光度計（日本島津公司）;AL204電子分析天平（梅特勒－托利多儀器有限公司）;PHS－3B pH計（上海雷磁儀器廠）。

久效磷標準品（上海市農(nóng)藥研究所，純度為97.4%）;腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶為生物試劑，購自上海生工生物技術有限公司;Tris、HCl、NaCl、KCl、MgCl2均為分析純;實驗用水均為超純水。

1.2 試驗設計

首先研究不同 pH 值（分別為 7.0、7.2、7.4、7.6、7.8）條件下，久效磷與四種堿基的作用程度;然后在最適 pH 值條件下，研究 Na+濃度（分別為100mmol/L、200mmol/L、300mmol/L、400mmol/L）、K+濃度（分別為 20mmol/L、40mmol/L、60mmol/L、80mmol/L）、Mg2+濃度（分別為 5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L）對它們的相互作用的影響;最后在最適的pH值、離子強度下，研究久效磷與四種堿基的作用。

1.3 紫外吸收光譜的測定

在不同pH值及離子強度的50 mmol/L Tris緩沖溶液條件下，取兩個1cm石英比色皿，向一個比色皿中加入3mL濃度為0.05mmol/L的久效磷溶液，另一個比色皿加入等量緩沖溶液，分別用濃度為5mmol/L的腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶四種堿基溶液依次進行滴加，混勻，放置5min，以試劑空白為參比，掃描其200～350nm的紫外吸收光譜，每次滴加體積為10μL，因此可忽略體積效應［11－12］，重復進行4次滴加掃描（即久效磷與堿基摩爾比分別為3∶0、3∶1、3∶2、3∶3、3∶4）記錄其特征吸光峰并按下式計算吸光度的變化率。

其中:A3∶0為久效磷與堿基摩爾比為3∶0時的久效磷的吸光度，A3∶4為久效磷與堿基摩爾比為3∶4時的久效磷的吸光度。

2 結果與分析

2.1 pH對久效磷與堿基作用的影響

在各pH條件下，隨著四種堿基濃度的增加，久效磷215nm左右的峰有明顯紅移和減色效應，說明久效磷與堿基發(fā)生了不同程度的作用。減色效應可能因為久效磷的π*空軌道與堿基的π軌道發(fā)生偶合，使能量降低，導致π－π*躍遷能量減少，偶合后的π*軌道因部分填充電子，使π－π*躍遷幾率減?。?3］。紅移程度及吸光度的變化率如表1所示，由表1可知，pH 7.6時隨著腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶濃度的增加，久效磷的特征吸收峰有1～2nm的紅移現(xiàn)象，吸光度變化率最大，說明此體系下久效磷與腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶的作用最強。而對于胸腺嘧啶，pH 7.8時對久效磷特征吸收峰的影響較大，pH 7.6時次之。綜合考慮將pH 7.6定為最適的pH緩沖體系。

表1 pH對久效磷與堿基作用的影響Table 1 Effect of pH on interaction between monocrotophos and bases

2.2 Na+對久效磷與堿基作用的影響

在pH7.6的條件下，改變緩沖液中Na+的濃度，考察Na+對久效磷與堿基作用的影響，結果如表2所示。由表2可知，對于腺嘌呤和胞嘧啶，添加Na+時的吸光度變化率均小于未添加Na+時的吸光度變化率，說明Na+對久效磷與腺嘌呤、胞嘧啶的作用有抑制效應，但Na+對維持核酸適體的二級結構有一定作用，因此添加一定的Na+是必須的。在Na+濃度200 mmol/L時，隨著腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶的添加，吸光度的變化率最大，此時它們與久效磷的作用最強，此時鳥嘌呤與久效磷的作用也較強，因此Na+濃度定為200 mmol/L。

表2 Na+對久效磷與堿基作用的影響Table 2 Effect of Na+on interaction between monocrotophos and bases

2.3 K+對久效磷與堿基作用的影響

在pH7.6的條件下，改變緩沖液中K+的濃度，考察K+對久效磷與堿基作用的影響，結果如表3所示。由表3可知，K+對久效磷與腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶的作用有抑制作用，但在40 mmol/L時，吸光度的變化率相對較大。20 mmol/L的K+可以促進久效磷與胸腺嘧啶的作用，而在較大濃度時又抑制久效磷與堿基的作用。綜合考慮久效磷與四種堿基的作用情況，K+濃度定為40 mmol/L。

表3 K+對久效磷與堿基作用的影響Table 3 Effect of K+on interaction between monocrotophos and bases

2.4 Mg2+對久效磷與堿基作用的影響

在pH7.6的條件下，改變緩沖液中Mg2+的濃度，考察Mg2+對久效磷與堿基作用的影響，結果如表4所示。由表4可知，添加Mg2+時的吸光度變化率均小于未添加Mg2+時的吸光度變化率，說明Mg2+對久效磷與腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶的作用都有較強的抑制作用，但在15 mmol/L時，吸光度的變化率相對較大，此時久效磷與堿基間的作用相對較強，綜合考慮將Mg2+濃度定為15 mmol/L。

表4 Mg2+對久效磷與堿基作用的影響Table 4 Effect of Mg2+on interaction between monocrotophos and bases

2.5 混合離子對久效磷與堿基作用的影響

在pH7.6及各離子的最適濃度下，考察混合緩沖溶液中久效磷與堿基作用的強弱。結果發(fā)現(xiàn)隨著四種堿基的不斷滴加，久效磷的特征吸收峰發(fā)生減色效應，均出現(xiàn)不同程度的紅移現(xiàn)象。滴加腺嘌呤時，久效磷的特征吸收峰紅移2nm，吸光度的變化率為2.52%;滴加鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶時，久效磷的特征吸收峰紅移1nm，吸光度的變化率分別為1.51%、4.59%、3.23%。因此，四種堿基與久效磷的作用程度大小依次為胞嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤。因此在構建核酸適體庫時，可以適當增加胞嘧啶和胸腺嘧啶的比例。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，久效磷和四種堿基的相互作用程度有較大差異，同種堿基在不同緩沖體系的條件下與久效磷的作用程度也不同，可能是久效磷的分子結構中含有P=O，通過P=O鍵作為H的受體與堿基中的－NH2，－NH提供的H結合形成NH—O鍵［14］，由于不同堿基結構里的－NH2，－NH基團數(shù)量不同致使久效磷與堿基的相互作用程度有較大差異。此外，金屬離子對久效磷與堿基結合的影響主要取決于金屬離子與堿基結合的類型及強弱，與堿基結合能力越強的金屬離子，在競爭反應中能夠降低久效磷與堿基的結合［15］，表現(xiàn)出抑制作用。金屬離子與堿基結合的穩(wěn)定性主要取決于離子電荷和半徑，所帶電荷越高與堿基結合穩(wěn)定性越強，Mg2+的結合穩(wěn)定性強于Na+、K+，故Mg2+對久效磷與堿基的抑制作用最明顯。又由于K+離子半徑大于Na+離子半徑，K+的結合穩(wěn)定性大于Na+，因此，K+對久效磷和堿基的抑制效果更強。

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